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lelletta5
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Città: nettuno

15 Messaggi

Inserito il - 12 gennaio 2007 : 11:00:47

chi mi può spiegare la differenza tra un saggio enzimatico continuo e discontinuo?

...è una gara ..chi me lo spiega meglio vince!

...

chick80
Moderatore

Città: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 12 gennaio 2007 : 23:37:34

Supponi di avere un enzima che cambia un substrato rosso in trasparente.

In un saggio continuo metti un po' di substrato e un po' di enzima in una cuvetta e dici allo spettrofotometro di leggere i valori di assorbanza continuamente. Alla fine avrai una curva attività/tempo.
Nel saggio discontinuo prendi un'aliquota della tua miscela di reazione ad es. ogni 10 minuti e leggi l'assorbanza allo spettrofotometro, poi fai una regressione dei punti così ottenuti.

Ovviamente i saggi non devono essere necessariamente spettrofotometrici.

Vedi:
http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_assay

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Anyra
Utente Junior

Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara

212 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2007 : 10:09:57

Un saggio continuo ti misura l'attività di un enzima analizzando:
1) La scomparsa di un substrato
2) La comparsa di un prodotto
3) la variazione di un cofattore (tipo NAD+)
Si può utilizzare un dosaggio continuo quando tra substrati e prodotti esiste una differenza nello spettro di assorbimento.
Es
dosaggio della G6PD (Glucosio 6 Fosfato deidrogenasi

Glucoso 6 fosfato + NADP+ ----> 6Fosfogluconato + NADPH

Si dosa a 340 nm e si misura la comparsa di NADPH (la comparsa è direttamente proporzionale all'attività dell' enzima)

Nel saggio discontinuo la reazione da dosare non ha prodotti, substrati oppure cofattori che variano in assorbimento per questo si accoppia alla reazione da dosare una seconda reazione che invece può essere dosata.

Es
la reazione dell'esocinasi

Glucosio + ATP -----> Glucosio 6P + ADP
non potrebbe essere dosata perchè sia i substrati che i prodotti hanno gli stessi spettri di assorbimento

Per questo si accoppia la reazione della G6PD:

Glucosio + ATP -----> Glucosio 6P + ADP

Glucoso 6 fosfato + NADP+ ----> 6Fosfogluconato + NADPH

Si valuta in questo caso la comparsa di NADPH che è proporzionale alla concentrazione di G6P che viene via via prodotto dall'esocinasi.

Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw

siffredina
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 30 maggio 2007 : 13:46:13

ciao sono una studentessa di biotecnologie. Per rimanere in tema vorrei chiedere un informazione su come posso usare una proteina per saggi enzimatici dopo averla purificata. Grazie

Biochica
Utente Junior

285 Messaggi

Inserito il - 30 maggio 2007 : 15:27:45

Citazione:
come posso usare una proteina per saggi enzimatici dopo averla purificata

a dire la verità come domanda è un po' vaga...dipende dalla proteina...se è una proteina che fa virare coloricamente il suo substrato puoi misurarla allo spettrofotometro come diceva chick, se è una proteina che attiva dei geni puoi estrarre l'rna delle cellule che hai trattato, se è una proteina che metabolizza dei substrati e li converte in qualcos'altro vai a cercare la loro comparsa/scomparsa...sempre se ho capito bene la tua domanda...

Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit-

siffredina
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 02 giugno 2007 : 12:00:52

grazie per l'aiuto biochica, adesso so più o meno come muovermi. il fatto è che in laboratorio abbiamo purificato il dominio SH3, adesso nella relazione dovrò elencare i vari esami come pull down, doppio ibrido e anche saggi enzimatici. Per questo chiedevo informazioni.

biologomolecolare84
Nuovo Arrivato

Prov.: Rm
Città: Roma

69 Messaggi

Inserito il - 23 aprile 2010 : 13:11:55

Ciao a tutti...ho bisogno di aiuto!
Per la mia tesi di laurea specialistica sto studiando un enzima che converte un substrato (di cui non conosco molto ma mi informerò) in ossido nitrico (NO). Ho già fatto analisi di Western Blot e adesso vorrei sapere quanto NO viene prodotto sotto certe condizioni da me fissate. Poichè non ho idea di come si faccia un saggio enzimatico (non ne ho mai fatti) e non possiedo un protocollo da seguire....mi aiutereste?
Grazie anticipatamente a tutti!!!