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Derek82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
 Inserito il - 17 gennaio 2007 : 17:05:52
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nn riesco a capire le diff tra questi 2 gel....o meglio ho trovato delle differenze riguardo le dimensioni "della rete " che fa passare molecole di variia grandezza ma nn è sufficiente x la mia prof.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2007 : 21:52:24
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Mi sembrava ci fosse un vecchio topic a proposito, ma non lo trovo più.
Ad ogni modo, i gel di poliacrilamide hanno come hai detto delle maglie più fini quindi ti permettono di avere una risoluzione maggiore, nel senso che ad es. puoi distinguere frammenti che differiscono solo per 1bp (utile ad es. nel sequenziamento).
I gel d'agarosio d'altra parte sono utili perchè permettono di separare anche frammenti molto grossi che non riusciresti a separare con la poliacrilammide (oltre al fatto che l'acrilamide è neurotossica).
A seconda della percentuale di agar o di poliacrilamide ovviamente poi avrai una risoluzione diversa. Percentuali più alte implicano maglie più fine e tempi di corsa più lunghi.
La poliacrilamide inoltre è usata anche per la separazione di proteine (es. SDS-PAGE).
Sicuramente ci saranno altre differenze ma al momento non mi viene in mente altro :)
ciao
nico |
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Derek82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2007 : 21:56:51
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grazie nicoooooooo |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2007 : 22:21:41
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L'agarosio SOLIDIFICA, l'acrilamminde POLIMERIZZA!!  *
* E' una cosa che un prof della triennale di Bologna mi ha ripetuto (a me e agli altri studenti) fino alla morte.
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Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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Derek82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2007 : 14:11:04
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| e cosa significa che uno solidifica e l altro polimerizza???...cioè che vantaggi hanno o svantaggi??? |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2007 : 14:54:23
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è una questione di differenti sostanze.
L'agarosio è una polvere che si scioglie solo dopo bollitura, quando la temperatura della soluzione si abbassa solidifica creando un gel (esattamente come la gelatina per dolci).
Lìacrilammide invece è una molecola che a seguito di una reazione radicalica polimerizza e si "trasforma" in un gel solido.
inoltre volendo un gel d'agarosio lo puoi risciogliere mentre il gel di poliacrilammide una volta polimerizzato non torna più liquido.
Vantaggi o svantaggi ???????????
se devi purificare un frammento di DNA dopo una corsa elettroforetica il gel d'agarosio è quello indicato.
Il gel di poliacrilammide se non sbaglio viene utilizzato per la separazione di frammenti a single strand in condizioni denaturanti, cosa che non si può fare con l'agarosio penso.
Ciao |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2007 : 14:56:22
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Citazione:
Messaggio inserito da dallolio_gm
L'agarosio SOLIDIFICA, l'acrilamminde POLIMERIZZA!! *
* E' una cosa che un prof della triennale di Bologna mi ha ripetuto (a me e agli altri studenti) fino alla morte.
Interessa anche me, cioè, apparte la differenza di processo (uno è un processo fisico, l'altro chimico) perchè ci teneva tanto a puntualizzare questa cosa il prof.? |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2007 : 17:03:30
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Per riassumere tutto quello che è stato detto ecco un po’ di appunti tratti da:
Molecular Cloning – Sambrook e Russell –CSHL PRESS
I gel di Agarosio e di polyacrilamide possono essere fatti di varie dimensioni e porosità.
La scelta dei diversi parametri dipende prima di tutto dalla grandezza dei frammenti che devono essere separati.
I gel di Polyacrilamide sono utilizzati per separare frammenti di dsDNA in base alla grandezza e ssDNA in base alla grandezza e alla conformazione, sono utili per separare piccoli frammenti di DNA (5-500bp).
I gel di Polyacrilamide hanno tre vantaggi rispetto ai gel di Agarosio:
- 1. il loro potere di risoluzione è così elevato che possono separare molecole la cui lunghezza differisce anche di solo 0.1% (x es. 1 bp in 1000 bp)
- 2. possono contenere quantità di DNA molto maggiori che i gel di Agarosio. In un pozzetto di un tipico gel di polyacrilamide (1cm x 1mm) possono essere caricati fino a 10ug di DNA senza significante perdita di risoluzione.
- 3. il DNA recuperato dai gel di polyacrilamide è estremamente puro e può essere utilizzato per gli scopi più delicati (x es. microiniezione negli embrioni di topo).
Hanno lo svantaggio di essere più difficili da preparare e da utilizzare rispetto ai gel di agarosio.
Vengono fatti migrare in posizione verticale e con un campo elettrico costante.
I gel di agarosio hanno un potere di risoluzione inferiore rispetto ai gel di polyacrilamide, ma hanno un maggiore range di separazione, posso essere separati DNA da 50bp fino a diverse megabasi. Il gel di agarosio viene fatto migrare in posizione orizzontale con un campo elettrico costante in forza e direzione. In queste condizioni la velocità dei frammenti di DNA diminuisce all’aumentare della loro grandezza ed è proporzionale alla forza del campo elettrico.
Gel di Polyacrilamide denaturante : sono utilizzati per la separazione e la purificazione di frammenti di ssDNA. questi gel vengono fatti polimerizzare in presenza di un agente (urea e/o meno frequentemente formamide) che sopprime il legame delle basi negli acidi nucleici. Il DNA denaturato migra in questi gel ad una velocità che è quasi completamente indipendente dalla sua composizione in basi e sequenza. Tra gli utilizzi del gel di Polyacrilamide denaturante ci sono l’isolamento di sonde di DNA radiomarcate, l’analisi dei prodotti di digestione con la nucleasi S1 e l’analisi dei prodotti di reazioni di sequenziamento.
Gel di Polyacrilamide non-denaturante : sono utilizzati per la separazione e la purificazione di frammenti di dsDNA. In genere i DNA a doppio filamento migrano a velocità inversamente proporzionali al log10 della loro dimensione. Tuttavia la mobilità elettroforetica è influenzata anche dalla loro composizione in basi e dalla sequenza, così che DNA duplex della stessa grandezza possono differire di mobilità anche del 10%. Gel di Polyacrilamide non denaturanti sono utilizzati sono utilizzati soprattutto per preparare frammenti di DNA altamente purificati e per visualizzare complessi di DNA-Proteine.
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Per quanto riguarda polimerizzazione e solidificazione ti ha già risposto Anyra, posso solo aggiunge che cambia la struttura delle maglie.
Nel gel di polyacrilamide ci sono 2 sostanze che vengono "crosslinkati" che sono l'acrilamide e la bis-acrilamide, sotto vedi la struttura che si forma.
Immagine:
25,67 KB
Questi sono due tabelle che ti danno idea della risoluzione dei gel a diverse percentuali:
% Agarosio -- bp DNA
0,3% ------ 60.000 - 5.000
0,6% ------ 20.000 - 1.000
0,7% ------ 10.000 - 800
0,9% ------ 7.000 - 500
1,2% ------ 6.000 - 400
1,5% ------ 4.000 - 200
2,0% ------ 3.000 - 100
Conc. Monomero di Acrylamide(%)---- Effettivo Range di Separazione (bp)
3.5 ---------------------------------------1000-2000
5.0 ----------------------------------------- 80-500
8.0 ------------------------------------------60-400
12.0 ---------------------------------------- 40-200
15.0 ---------------------------------------- 25-150
20.0 ----------------------------------------- 6-100
Ciao
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Derek82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2007 : 17:35:39
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| grazie mille...una spiegazione perfetta |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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orcaimpetuosa
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2007 : 11:25:26
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| e che dire della tossicità l'acrilammide è molto tossica mentre l'agarosio no, una volta mi è caduta l'acrilammide sulle scarpe e mi hanno consigliato di buttarle (col ***** che l'ho fatto!) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2007 : 12:33:36
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Preciserei che l'acrilamide è tossica PRIMA di polimerizzare, mentre il polimero non è tossico (cioè, non è che uno se lo possa mangiare tranquillamente... ma è molto meno pericoloso del monomero).
Ad ogni modo l'agar di solito si usa in combinazione con l'EtBr quindi.... |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
 Inserito il - 25 gennaio 2007 : 14:02:34
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A volte un po di tossicità ci vuole nella vita............
Troppa gente lavora con leggerezza in laboratorio, magari lo spettro di una sostanza teratogena o neurotossica potrebbe migliorare la loro attenzione.
Io non dico mai che l'acrilamide perde la sua tossicità dopo la polimerizzazione......
i miei interni sono tra i più richiesti per la loro accuratezza nel lavorare.. |
Il mio Cavaliere
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 gennaio 2007 : 14:12:29
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| ci dovrebbe essere un'altra differenza tra acrilamide ed agarosio, e cioè la loro natura chimica. mentre l'agarosio è una sostanza naturale, estratta dalle alghe, l'acrilamide è sintetica. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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pinkstardust
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 26 gennaio 2007 : 15:47:28
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Citazione:
Messaggio inserito da Iside
ci dovrebbe essere un'altra differenza tra acrilamide ed agarosio, e cioè la loro natura chimica. mentre l'agarosio è una sostanza naturale, estratta dalle alghe, l'acrilamide è sintetica.
 c'è anke un altra differenza seppur trascurabile MA che all'esame di biologia molecolare 2 mi hanno domandato e non ho risposto (perchè credevo fosse sottointeso...e invece no! )
ovvero che la poliacrilammide corre in verticale mentre l'agarosio orizzontale (altrimenti si creerebbe una differenza di concentrazione tra la sommità più alta e la più bassa) :)
a buon rendere :) |
:) w il libero arbitrio :) |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 26 giugno 2011 : 20:58:50
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Citazione:
Messaggio inserito da domi84
Citazione:
Messaggio inserito da dallolio_gm
L'agarosio SOLIDIFICA, l'acrilamminde POLIMERIZZA!! *
* E' una cosa che un prof della triennale di Bologna mi ha ripetuto (a me e agli altri studenti) fino alla morte.
Interessa anche me, cioè, apparte la differenza di processo (uno è un processo fisico, l'altro chimico) perchè ci teneva tanto a puntualizzare questa cosa il prof.?
Anche se olderrima ci tenevo a rispondere: una differenza, che nella pratica laboratoristica potrebbe essere utile ricordare, è che la formazione del gel è un fenomeno irreversibile per l'acrilammide/bisacrilammide, per l'agarosio è sufficiente scaldare (sopra i 60°C credo sia sufficiente). Inoltre in qualche modo hai un maggior controllo sulla "gelificazione" dell'acrilammide, decidi tu quando parte, aggiungendo il TEMED.
Infine, e mi chiedo se possa avere qualche ricaduta in lab, con l'acrilamide il processo di reticolazione si avvia in modo decisamente più"netto", appunto all'aggiunta del catalizzatore. Con l'agarosio sarei tentato di pensare che il processo "acquista velocità" al diminuire della temperatura... |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 26 giugno 2011 : 21:42:00
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Inoltre in qualche modo hai un maggior controllo sulla "gelificazione" dell'acrilammide, decidi tu quando parte, aggiungendo il TEMED.
Anche del gel di agarosio hai tu un controllo...basta prepararlo e conservarlo in una stufa sopra i 60°C, quanto ti serve lo tiri fuori 
Citazione:
Con l'agarosio sarei tentato di pensare che il processo "acquista velocità" al diminuire della temperatura...
e già |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 26 giugno 2011 : 21:50:43
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Temo di essermi espresso malamente. Come tu giustamente osservi anche sull'agarosio hai il controllo dello start. Ciò che intendevo sottolineare, e avrei fatto meglio a non scorporare l'ultimo paragrafo in quanto è funzionale al discorso, è che il confine di inizio della solidificazione è più sfumato rispetto a quello della polimerizzazione.
Grazie della puntualizzazione.
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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bontix
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 06:00:54
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La differenza maggiore a livello aplicativo è la capacità risolvente.
Mentre l'agarosio ha maglie larghe il gel di poliacrilammide più è concentrato più le maglie sono strette....si parla di setaccio molecolare.
L PAA permette di separare molecole di DNA che divergono anche per un solo nucleotide cosa che non sarebbe possibile con l'agarosio. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 08:43:13
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Citazione:
Anche del gel di agarosio hai tu un controllo...basta prepararlo e conservarlo in una stufa sopra i 60°C, quanto ti serve lo tiri fuori
E perchè sprecare energia tenendo una stufa a 60 gradi? Ti tieni il tuo bloccone di agarosio solido in una beuta e quando serve lo sbatti 2 minuti in microonde! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 10:12:12
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Citazione:
Messaggio inserito da bontix
La differenza maggiore a livello aplicativo è la capacità risolvente.
Mentre l'agarosio ha maglie larghe il gel di poliacrilammide più è concentrato più le maglie sono strette....si parla di setaccio molecolare.
L PAA permette di separare molecole di DNA che divergono anche per un solo nucleotide cosa che non sarebbe possibile con l'agarosio.
Giustamente.
Ma dal momento che siamo dei creativi cerchiamo altre differenze...
A questo proposito, mi togliereste una curiosità?
Da quel che so, è impossibile recuperare dal gel di poliacrilammide i propri campioni, senza frammentarli come avviene per es. negli esperimenti di MS con tripsina. Ciò è dovuto al fatto che le maglie sono frutto di una reazione irreversibile.
La solidificazione dell'agarosio è invece reversibile, come detto in un messaggio qui sopra. Potrei in teoria recuperare il mio campione dalla soluzione di gel sciolto al calore? |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 15:45:51
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| Non so nulla a riguardo...ma mi butto per un sì (lo so, sono di grande aiuto!) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 16:26:32
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
A questo proposito, mi togliereste una curiosità?
Da quel che so, è impossibile recuperare dal gel di poliacrilammide i propri campioni, senza frammentarli come avviene per es. negli esperimenti di MS con tripsina. Ciò è dovuto al fatto che le maglie sono frutto di una reazione irreversibile.
Si può, si può!
Il concetto è banalissimo in fondo, allo stesso modo in cui il campione è entrato nel gel può uscire!
I metodi sono essenzialmente 2:
- diffusione: il campione "diffonde" al di fuori del gel.
Però essenzialmente non è semplicissimo e per semplice diffusione dal gel la resa è molto bassa, quindi per accelerare il processo in genere dopo aver exciso il pezzo di gel contenete la banda questo viene spezzettato per favorire la diffusione del campione al di fuori del gel. Poi ovviamente ci sono vari protocolli e diverse varianti: scaldare il campione, sonicare...
- elettroeluizione: si applica un campo elettrico e il campione "migra" fuori dal gel.
Il metodo è sicuramente più fine, la resa è molto maggiore e il campione è "intatto" ma il problema è che ci vuole la strumentazione apposta.
Questo in 2 parole è il concetto, ovviamente vale sia per acidi nucleici che per proteine con le opportune variazioni di protocolli. Entrambi i metodi possono essere utilizzati anche per i gel di agarosio, ma in genere per quelli si dissolve il gel e si purifica su colonnine.
Qua trovi una spiegazione che mi sembra molto chiara: http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/40 |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 18:12:31
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
A questo proposito, mi togliereste una curiosità?
Da quel che so, è impossibile recuperare dal gel di poliacrilammide i propri campioni, senza frammentarli come avviene per es. negli esperimenti di MS con tripsina. Ciò è dovuto al fatto che le maglie sono frutto di una reazione irreversibile.
Si può, si può!
Il concetto è banalissimo in fondo, allo stesso modo in cui il campione è entrato nel gel può uscire!
In effetti rileggendomi ora mi sono reso conto di aver detto una fregnaccia. Dopotutto si fanno prove a vari deltaT per valutare la durata della corsa appunto per evitare che in futuro il campione si perda all'esterno del gel. E soprattutto, come entra deve uscire.
Non so da dove mi fosse uscita questa fissa, la cosa più interessante è che però si possa recuperare da banda singola.
Grazie GFPina, sei inestimabile.
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 20:00:37
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No beh era una domanda lecita la tua!
É vero che basterebbe far migrare tanto un gel per far uscire il campione allo stesso modo in cui è entrato, ma non sarebbe molto saggio! Il principio è quello ma c'è il modo giusto per farlo, quindi è giustissimo chiedersi come fare. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 20:53:53
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Il link me lo sono comunque salvato, per il futuro in lab tornerà utile
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So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
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Discussione |
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diff tra gel di agarosio e poliacrilammide
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