Pcr con aspecifico

Forum

Registrati Discussioni Recenti Preferiti Utenti Cerca Regolamento RSS Statistiche

Utilità

I libri
consigliati:

Genetica
Susan L. Elrod, William D. Stansfield

Fondamenti di biochimica
Charlotte W. Pratt, Donald Voet, Judith G. Voet

Il gene VI
Benjamin Lewin

Altri Libri

Nome Utente:	Password:
Riconoscimi automaticamente

Tutti i Forum

MolecularLab

Biologia Molecolare

Pcr con aspecifico

Nuova Discussione

Nuovo Sondaggio

Rispondi

Aggiungi ai Preferiti

Cerca nelle discussioni

Risorse di Biologia Molecolare:

Didattica

Blog Inside the Cell

Protocolli

Siti di Biologia Molecolare e Tecniche

Quiz

Ultime notizie

Aggiungi i tag

Quanto � utile/interessante questa discussione:

Autore

Discussione

metilp
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 04 ottobre 2012 : 21:07:44

Ciao a tutti!!
Ho un problema con l'amplificazione di un frammento, che devo successivamente sottoporre a restrizione enzimatica (all'interno c'� uno SNP!).
Inizialamente sono riuscita a mettere a punto il protocollo (dopo un gradient che mi ha dato delle bellissime bande)ed effettuare la PCR e la successiva genotipizzazione di una ventina di campioni.
Da qualche settimana � sorto il problema: oltre ad avere il mio frammento di 350 bp, quando controllo la PCR ritrovo anche una strisciata di aspecifico compresa tra 100 e 250 bp, che da molti probelmi dopo la digestione, dato che quella � la zona del gel dove dovrebbero esserci le bande della digestione.
Ho provato a cambiare tutto (H2O, Taq, Primer, dNTP) e so che non si tratta di contaminazione perch� altri polimorfismi vengono molto bene...
Spero che qualcuno possa avere un suggerimento per cercare di eliminare l'aspecifico!...

Grazie!!

mollichina di pane
Utente Junior

121 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2012 : 21:00:19

Ciao metilp!
dunque...d� per scontato che tu abbia fatto un bianco nella tua pcr per dire con certezza che non ci sono contaminazioni.
Dal mio punto di vista potresti eliminare il problema correndo tutta la pcr che hai e tagliandoti poi solo la banda d'interesse. A quel punto purifichi da gel con kit o con un protocollo home-made e poi passi alla restrizione. E' certamente pi� veloce. Altrimenti devi giocare con la Ta. Alcuni tipi di polimerasi fanno questo genere di smear!