PCR per introdurre sito nel mezzo dell'amplicone

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Autore

Discussione

roberta.s
Utente Junior

Città: Parigi

564 Messaggi

Inserito il - 19 dicembre 2012 : 13:07:03

Ciao a tutti. Secondo voi puo' funzionare una PCR del genere?
Vi spiego. Ho un plasmide e vorrei introdurre all'estremità 5' del gene di mio interesse un sito di restrizione per effettuare un subclonaggio. Per motivi che non sto qui a spiegare NON posso fare una PCR del gene usando primers per aggiungere il sito, che chiamero' X. Pensavo dunque di fare nel seguente modo:
Amplifico il 5' della sequenza di mio interesse dal sito di restrizione A a quello B (questi siti sono già presenti in questa porzione del plasmide e mi serviranno per reinserire il pezzo dopo aver introdotto il sito aggiuntivo). Per fare la PCR uso un primer FW del tipo: NNNNNN-sitoA-NNNNNN-sitoX-sequenza complementare al plasmide. In tal modo vorrei introdurre il sito X, che mi servirà per il successivo subclonaggio nel vettore finale. Il dubbio é: la presenza del sitoA (che si trova già sul plasmide) prima del sitoX - che non è nel plasmide - potrebbe creare problemi? Io pensavo alla possibilità di formare delle hairpin che sarebbero d'intralcio. Ma, allo stesso tempo, credo che possa anche verificarsi il caso in cui l'estremità 5' del primer (fino al sitoX incluso) si comporti come una coda, non appaiandosi al target, il che sarebbe ottimo per la riuscita della PCR.

Aspetto commenti!

Grazie:)

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 19 dicembre 2012 : 16:47:43

Se ho capito bene la tua strategia, in effetti un primer del genere potrebbe darti problemi:
1° sarebbe un primer abbastanza lungo dato che dovresti mettere tutta quella sequenza nella coda e mettere abbastanza della sequenza del plasmide perché sia specifico.
2° il sito A che è complementare al plasmide in effetti si potrebbe appaiare e darti problemi.
La cosa più probabile che succeda è che alcuni primers si appaieranno nel modo "corretto" o (meglio quello che vuoi tu) mentre altri si appaieranno in modo "aspecifico". La PCR che vuoi tu potrebbe funzionare ma con una efficienza un po' bassa.

Ma fare una cosa del genere invece?
1° PCR con primer: NNNNNN-sitoX-sequenza complementare al plasmide
2° PCR con primer: NNNNNN-sitoA-NNNNNN-sitoX-(sequenza complementare al plasmide più corta rispetto a prima)

roberta.s
Utente Junior

Città: Parigi

564 Messaggi

Inserito il - 19 dicembre 2012 : 17:09:13

grazie mille per l'idea, GFPina! in realtà cosi' risolverei il problema, non ci avevo proprio pensato