In breve la tecnica dei due ibridi ti consente di studiare l'interazione fra due proteine.
Essenzialmente si sfrutta il fatto che la proteina Gal4 è costituita da due domains, uno che lega il DNA ed uno catalitico che promuove la trascrizione del gene a valle del sito di legame di Gal4.
Se tu dividi il gene di Gal4 in due parti, in modo da separare le due attività e fondi ciascuna di queste con una delle 2 proteine che stai studiando, ottieni qualcosa di questo tipo:
-----Gal4BD-Prot1---- ------Prot2-Gal4AD----
dove Gal4BD è il binding domain che lega il DNA e Gal4AD è l'activation domain che promuove la trascrizione.
Ovviamente la fusione deve essere fatta in frame, in modo che le proteine conservino (in massima parte) la struttura originale.
Ora, se tu metti questi 2 costrutti in un plasmide e trasfetti una cellula con questo plasmide e con un altro plasmide contenente un gene reporter (Lux, GFP o quello che vuoi tu) sotto il controllo di un promotore Gal, potrai avere 2 situazioni:
1) La proteina 1 lega la proteina 2:
Prot1::Prot2
| \
Gal4BD Gal4AD -----> Il gene viene trascritto
----GAL4 prom.---GENE---
2) Le due proteine non si legano
Gal4AD
/
Prot1 Prot2
|
Gal4BD --XX-> Il gene non viene trascritto
----GAL4 prom.---GENE---
Dopo questo meraviglioso esempio di ASCII-art (
)... ti saluto!
Spero di essermi spiegato chiaramente, in caso contrario chiedi pure, siamo qui apposta!
bye
nICO
metodologia del doppio ibrido
Didattica
Inserito il - 13 settembre 2004 : 21:27:14
Inserito il - 14 settembre 2004 : 18:50:34
