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kalos90135
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3 Messaggi |
 Inserito il - 15 gennaio 2013 : 13:08:42
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Salve a tutti,
sto svolgendo il tirocinio presso l'FHNW di Basilea. Mi hanno affidato un progetto nel quale devo produrre e caratterizzare un enzima (GHB deidrogenasi).
La produzione č andata bene, ma adesso mi trovo ad affrontare un problema: devo scoprire se questa proteina č un dimero o un monomero.
Come mi suggerite di procedere? Ho pensato ad una cromatografia ad esclusione molecolare o ad un SDS Page senza agenti riducenti. Avete dei consigli o anche dei protocolli? Grazie.
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2013 : 13:20:57
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Concordo con la size exclusion chromatography.
Pių che un SDS-PAGE dovresti fare una elettroforesi Nativa, l'SDS č un agente denaturante, potrebbe minare la stabilitā del dimero.
Inoltre potresti pensare ad una cromatografia di affinitā: produci il tuo enzima in fusione con un tag, fissi la proteina ricombinante ad una colonna cromatografica (es. le Gluthation Sepharose se hai una GST-tagged protein) e poi aggiungi l'enzima, purificato o pių facilmente in un estratto proteico. Effettui svariati lavaggi e poi carichi su gel.
Credo che sarebbe meglio avere un tag per entrambe: es un GST-tag per fissare alla resina e un myc-tag per la proteina di fusione che vai ad aggiungere, di modo da poter poi distinguere le due proteine in WB ricorrendo ad un anti-myc.
E poi puoi pensare alla FRET. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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kalos90135
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2013 : 14:33:38
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| Il mio enzima ha giā un His-tag. Quindi quello che tu suggerisci č di fare la purificazione e a questa stessa colonna aggiungere altro enzima giā purificato per vedere se avviene il binding??? |
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2013 : 14:54:58
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Per avere prova dell'interazione diretta che ti aspetteresti per un dimero, sė: dovresti purificare l'His-tagg protein e "l'altro enzima", magari taggato diversamente e poi verificare il binding con una crom. per affinitā.
Va anche detto che questo esperimento di direct binding fornisce una prova dell'esistenza di un multimero, non specificatamente di un DIMERO, se mi segui.
Per questo unirlo ad altre analisi, come. ad una size ex., č una buona idea. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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kalos90135
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2013 : 15:04:01
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| La strategia che hai descritto č sicuramente raffinata, ma prevede la costruzione di un nuovo plasmide con il secondo tag. Pensi che una semplice size-exclusion non sia sufficientemente precisa da potermi fare affermare che la proteina dimerizzi o meno? |
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lā
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2013 : 12:08:25
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| io mi sono trovata a dover capire se la mia proteina formasse dei dimeri, e per fare ciō ho fatto un gel nativo! |
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Iside
Utente Attivo
Cittā: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2013 : 14:19:31
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se su gel riesci a discriminare l'enzima con his-tag da quello senza his-tag, allora puoi provare la strategia proposta da 0barra1, magari usando un lisato totale come fonte di enzima libero.
altrimenti prova a dare un'occhiata a questo tipo di assay: http://www.olink.com/products-services/duolink/how-use-duolink |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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sashiolina
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Metodi per stabilire se una proteina č un dimero
Didattica
