Efficienza RT-PCR quantitativa

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Tazia
Nuovo Arrivato

21 Messaggi

Inserito il - 23 gennaio 2013 : 22:15:46

Ciao a tutti, studiando l'RT-PCR q. mi è sorto un dubbio: nei miei appunti ho scritto che per valutare l'efficienza si devono fare PCR con diluizioni scalari in modo da ottenere un fascio di curve. Da qui poi ricavare i CT e metterli in un grafico con CT sulle ordinate e Log n di cicli sulle ascisse. A questo punto con il metodo dei minimi quadrati calcolare la pendenza della retta che meglio approssima questi dati. La pendenza va inserita nella seguente formula:

100*[10^(-1/slope) -1]

Ad una pendenza di -3,32 corrisponde un'efficienza del 100%.
Questa formula però vale solo per efficienze molto alte e può essere utilizzata se un po' corretta per efficienze fino al 90%.

Se quanto detto fino qui è giusto, mi restano alcuni punti oscuri:

- Perché costruire una retta di taratura per verificare un'efficienza del 100%? Non basterebbe vedere se tra diluizioni che differiscono di un fattore 10 c'è una differenza di CT di 3,32? Il punto è che la pendenza della retta dà un'approssimazione dei dati?

- La formula non vale per efficienze più basse del 90 perché è "tarata" su una curva che segue 2^x?

- Se io ho una PCR qualsiasi e voglio sapere la sua efficienza come faccio a sapere se posso applicare la formula o no dato che non so se l'efficienza è maggiore del 90?

- Come si calcolano le efficienze minori?

Grazie in anticipo a tutti, intanto riprendo a spulciare il web e il forum

Tazia
Nuovo Arrivato

21 Messaggi

Inserito il - 23 gennaio 2013 : 23:00:46

Scusate, le ultime tre domande le ho risolte realizzando che quando il prof ha detto "la formula non funziona" intendeva dire che con efficienze inferiori non restituisce 100, non che non è applicabile!!!

Resta quindi solo la prima domanda :)