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gabo1991x
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
 Inserito il - 01 febbraio 2013 : 16:08:47
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Salve a tutti vorrei delle delucidazioni riguardo questa domanda:
"Come faccio a sapere se l'inserto si č inserito nel corretto orientamento all'interno del mio vettore?"
le strategie dovrebbero essere: sequenziamento,PCR, uso di enzimi di restrizione, corsa elettroforetica.
Qualcuno potrebbe dirmi come la pensa?
grazie
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2013 : 17:02:50
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| Se ti aggrada, illustraci brevemente cosa intendi con uso di enzimi di restrizione e corsa elettroforetica. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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gabo1991x
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2013 : 17:40:36
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| Il problema č che non ho ben capito come posso sfruttare il taglio con enzimi di restrizione che mi genera dei frammenti di cui poi faccio l'elettroforesi per determinare se l'orientazione dell'inserto era corretta! |
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Geeko
Utente
Cittā: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2013 : 21:28:01
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Questo lo puoi fare se hai a disposizione un sito di restrizione all'interno dell'inserto, diverso da quello usato per il clonaggio, che sia presente anche nel vettore.
Con un disegno si capirebbe molto meglio, ma la lunghezza dei frammenti ottenuti dopo digestione con l'enzima di restrizione scelto del DNA plasmidico sarā diversa in relazione al verso d'integrazione dell'inserto nel vettore. Puoi prevedere ancora prima di correre su gel quali bande ti aspetti di trovare nei due caso (integrazione nel verso giusto o in quello opposto), e poi verificare tutto con una elettroforesi.
Per questo approccio ovviamente hai bisogno di conoscere la sequenza dell'inserto per individuare i siti di restrizione che ci sono.
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gabo1991x
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2013 : 18:21:40
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| grazie mille! quindi laddove esistesse un sito di restrizione nell'inserto e nel vettore,digerisco e giā a priori mi aspetto dei frammenti di una certa dimensione (che posso verificare comunque con una elettroforesi su gel di agarosio). |
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Geeko
Utente
Cittā: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2013 : 18:32:20
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Sė, che devi verificare con elettroforesi!  |
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2013 : 21:13:18
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| Oltretutto il sito di restrizione all'interno dell'inserto deve essere unico o raro, altrimenti diventa troppo complicato all'aumentare delle bande. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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