Citazione:

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Messaggio inserito da GFPina

L'impostazione del threshold manuale non � una cosa facilissima.
Detto in poche parole deve stare nella fase esponenziale delle curve dei tuoi amplificati, per� non � facile trovare il punto dove vada bene per tutte le curve. Il modo migliore per vederlo visivamente � visualizzare le curve in modalit� logaritmica e mettere la soglia nella parte "retta" delle curve, dovresti anche vedere che le curve siano abbastanza parallele tra loro.
Per� prima di impostare la soglia devi controllare che la baseline sia adeguata, lo strumento (credo lo faccia anche il tuo) sceglie una baseline tra 3-15 cicli, ma dovresti vedere a che ciclo si amplifica il campione pi� espresso, una baseline ideale � circa 2 cicli prima rispetto all'amplificazione del tuo campione pi� espresso, questo vuol dire che se hai ad es. un campione che esce al 13 ciclo, non va bene come baseline e devi cambiarla manualmente.
Stabilita la baseline, la soglia deve essere almeno 10 deviazioni standard superiore rispetto alla baseline, in genere la macchina te ne imposta una in automatico calcolando 10 deviazioni standard sopra la baseline. Quindi se questa � impostata correttamente in genere va abbastanza bene. Se devi spostarla a mano tieni in considerazione quanto detto sopra:
- deve essere 10 deviazioni standard sopra la baseline
- deve essere nella fase esponenziale (lineare in modalit� logaritmica)
un altro criterio che ci pu� applicare, fermi restando i precedenti, � quello di guardare che nel punto dove si mete la soglia la ripetibilit� dei replicati sia massima.

Comunque non puoi impostarla cos� "a caso" ad es.

Citazione:

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Per esempio se imposto il threshold al valore di 0.3 alcuni campioni risultano negativi se abbasso il threshold anche a 0.1 ecco che gli stessi campioni risultano positivi seppur a valori di Ct alti.

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non ha alcun senso! Non importano i numeri 0.3 o 0.1, che variano da esperimento a esperimento ed estrapolati dal loro contesto (cio� come sono le curve) non hanno alcun significato, ma bisogna considerare le cose che ti ho scritto prima.

Nel caso avessi dei problemi potresti provare a sentire il supporto tecnico Applied e vedere se ti mandano, o se ti fanno almeno parlare con uno specialist.

Spero di essere stata abbastanza chiara vista l'ora!

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