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EROTAVLAS
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 Inserito il - 18 maggio 2013 : 01:15:37
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Ciao a tutti, vi spiego rapidamente il mio problema.
Partendo da aliquote di DH5alpha cortesemente regalate ho preparato delle cellule competenti. Per verificare la corretta preparazione delle mie cellule competenti "homemade" non avendo a disposizione il vettore di controllo pUC19 o fatto una normale trasformazione con vettore contente resistenza per Amp.
Protocollo di trasformazione:
50 uL di cell, 20 ng vettore, 30 min in ghiaccio, 45 sec a 42 °c, 2 min in ghiaccio, recovery 1 ora 37 °C in 0,95 mL LB, centrifugo 1 min a 5000 rpm, scarto 800 uL e piastro i restanti 200 uL su LB-Agar-Amp. Controllo negativo piastrando delle DH5a non trasformate.
Risultato: tappeto di cellule nel trasformato e un elevato numero di colonie anche nel controllo negativo!!!! Tenendo presente una nettissima differenza tra le 2 piastre...
Ok a questo punto ho pensato si trattasse di un problema relativo a piastra vecchie, amp degradata ecc..
Preparo nuove piastre e provo a trasformare con un vettore diverso con resitenza per kanamicina, ripeto il protocollo utilizzando 10 ng di vettore, e piastro 200 uL del 1 mL di recovery (2/10), centrifugo scarto 600 uL e piastro i 200 uL restanti (8/10)...
Risultato: tappeto nella pistra 8/10, tappeto un po meno fitto nella piastra 2/10, in cui posso anche distinguere alcune colonie singole, una 30ina di colonie nel controllo negativo!!!
Vi è mai successa una cosa simile con le DH5? E' possibile che la quantità di antibiotico usato sia troppo bassa?
Grazie a tutti
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Problemi di trasformazione con DH5alpha
Didattica
