| Autore |
Discussione |
|
|
Lord Garland
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 22 maggio 2013 : 22:45:39
|
Ciao a tutti. Io ho un serio problema:
mi serve come avere un certo promotore genomico. Se estraggo DNA da una cellula, come procedo per isolarmi quel preciso promotore?
Provo a buttare lì un'ipotesi; ditemi se siete d'accordo o no o se conoscete altre possibilità: sono tutt'orecchi:
ho una cellula --> estraggo genomico --> Uso enzimi di restrizione per spezzettarmi il DNA (qui non so molto - chi mi illustra questo punto?) --> userò enzimi di restrizione che non tagliano il mio promotore --> faccio una PCR con il primer Forward e Reverse del mio promotore --> Lo isolo e lo uso per lo studio. E' giusto?
|
|
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2013 : 18:43:14
|
| Se conosci la sequenza non ti serve digerire il genomico. Basta estrarlo e con i primers che ti sei disegnato (sempre ovviamente che tu conosca la sequenza) ti fai una bella PCR per amplificarlo. Io ho fatto così per un promotore di Xenopus laevis. |
 |
 |
|
|
zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2013 : 21:54:07
|
Tecnicamente è sufficiente una PCR come dice il saggio SpemannOrganizer, tuttavia il grosso del problema dei promotori è capire dove esattamente inizino!!!!!.
Per convenzione quando si amplifica un promotore nuovo, si amplificano "n-kilobasi" subito a monte dell'atg (codone di inizio della traduzione). A monte dell'atg troverai sicuramente la 5'utr del gene (se esiste) e quindi la sequenza del promotore propriamente detto, e se sei sfortunato diversi introni(anche mooolto grossi) tra l'atg e il tuo promotore agognato. Il punto di problema è che le sequenze regolatorie del tuo promotore possono essere sparse anche a valle di esso, quindi nella 5'utr del gene, negli introni (capita molto spesso) e addirittura all'interno della sequenza tradotta (0_0).
Tutto questo per dire che isolare un promotore non è cosa affatto banale! |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
|
|
|
|
domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
|
| |
Discussione |
|
Promotori - come ottenerli?
Didattica
