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federica81
Nuovo Arrivato
Prov.: Modena
Città: modena
9 Messaggi |
 Inserito il - 15 febbraio 2007 : 16:03:50
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ciao ragazzi, io ho un problema di efficienza di amplificazione dei primer. Lo slope delle curve di amplificazione (Ct verso log RNA) è intorno a 2,5 per il target (efficienza > 100%) e invece 3.3 per l'endogeno (efficienza perfetta del 100%). Secondo voi da che cosa può dipendere un valore così alto di efficcienza??
Qualcuno ha mai usato il software REST (Plaff) per poter validare il metodo di quantizzazione delta delta Ct in real time PCR quando le efficienze dei primer del target e dell'endogeno sono diverse? Nel caso di un efficienza maggiore del 100 % si può usare comunque questo software?
Grazie mille.
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
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barbapapà
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2007 : 12:36:51
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Citazione:
Messaggio inserito da federica81
ciao ragazzi, io ho un problema di efficienza di amplificazione dei primer. Lo slope delle curve di amplificazione (Ct verso log RNA) è intorno a 2,5 per il target (efficienza > 100%) e invece 3.3 per l'endogeno (efficienza perfetta del 100%). Secondo voi da che cosa può dipendere un valore così alto di efficcienza??
Qualcuno ha mai usato il software REST (Plaff) per poter validare il metodo di quantizzazione delta delta Ct in real time PCR quando le efficienze dei primer del target e dell'endogeno sono diverse? Nel caso di un efficienza maggiore del 100 % si può usare comunque questo software?
Grazie mille.
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barbapapà
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2007 : 12:50:29
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Dunque Federica,
innanzitutto permettimi di dirti che lo slope della retta standard (Ct verso log DNA) si esprime come valore negativo (quindi -3.3 o -2.5) e non come valore positivo...
Lo slope è correlato con l'efficienza di PCR secondo la seguente formula:
E = [10 exp (-1/slope)] - 1
Con un valore di slope di -2.5 hai quindi un'efficienza del 150%.
Generalmente l'efficienza è così alta quando gli standard a concentrazione più alta della curva standard sono affetti da inibizione.
Che succede se elimini dall'analisi gli standard a concentrazione più alta? Migliora l'efficienza?
Fammi sapere e se riesci mandami copia della curva standard (con il software Opticon Monitor dovresti riuscire ad esportare l'immagine della curva standard). prova a mandarmela.
ciao |
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federica81
Nuovo Arrivato
Prov.: Modena
Città: modena
9 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2007 : 14:42:52
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Eliminando i valori a più alta concentrazione della curva l'efficienza migliore raggiunge valori meno positivi (tipo -2,8)...Questo effetto di inibizione della PCR può dipendere dalla qualità del campione. Io estraggo RNA con Trizol e lo tratto con DNAse che dopo inattivo per via chimica. Quindi è probabile che mi porto dietro dei sali o delle proteine che danno problemi.
Inoltre volevo sapere se secondo te con questi parametri di efficienza è possibile usare il software REST per l'analisi delta delta Ct dei dati.
Se faccio una curva con fattori di diluizione 1:2, il valore di riferimento dell'efficienza rimane sempre -3.33??
Grazie mille. ciao |
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barbapapà
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2007 : 15:14:12
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Hai provato a verificare la qualità del tuo RNA allo spettrofotometro (A260/A280) e/o su gel?
Non conosco il software REST ma ho trovato una pubblicazione del 2002 di Pfaffl, me la leggo e lunedì ti do la mia opinione.
L'efficienza di PCR (cioè lo slope della retta di taratura) non dipende dal tipo di diluizione che fai. L'efficienza è del 100% se lo slope è -3.3, sia che la tua retta tu l'abbia ottenuta con diluizioni 1:2 sia che tu l'abbia ottenuta con diluizioni 1:10.
Posso chiederti che strumento real time utilizzi?
Che tipo di standard utilizzi? e' DNA genomico oppure cDNA?
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federica81
Nuovo Arrivato
Prov.: Modena
Città: modena
9 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2007 : 15:26:24
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Allo spettrofotometro ho delle ratio che oscillano tra 1,8 e 2,2..comunque per risolvere il problema della qualità pensavo di fare un clean up dell'RNA su colonna. Ti farò sapere se cambia qualcosa.
Utilizzo il 7900 Fast HT.
Lo standard che uso è GAPDH e lavoro con SYBR GREEN. Si tratta di cDNA.CIAO |
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barbapapà
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2007 : 15:27:10
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Ho letto rapidamente l'articolo di Pfaffl sul software REST e sembrerebbe che il software esegue una correzione automatica se le efficienze di target e riferimento sono diverse.
Ma senti altre opinioni, io non l'ho mai utilizzato!!
Volevo chiederti: l'amplificazione del tuo gene target è specifica? Cioè, cosa ottieni se, dopo PCR, fai una curva di melting? ottieni 1 o più picchi? Forse l'efficienza è così alta per un'amplificazione aspecifica del tuo target. L'hai messo a punto tu il saggio? E poi perchè utilizzi il Sybr green invece delle sonde?
Ti faccio un sacco di domande, magari inopportune, ma voglio cercare di capire il tuo problema!
ciao |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 04 luglio 2012 : 23:16:21
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[quote]Messaggio inserito da barbapapà
Dunque Federica,
innanzitutto permettimi di dirti che lo slope della retta standard (Ct verso log DNA) si esprime come valore negativo (quindi -3.3 o -2.5) e non come valore positivo...
Lo slope è correlato con l'efficienza di PCR secondo la seguente formula:
E = [10 exp (-1/slope)] - 1
Ciao a tutti! mi inserisco in questa discussione un pò vecchia..
volevo chiedere se mi sapete sire perchè usate questa formula per calcolare l'efficienza..ovvero nelle formule che conosco e che ho trovato da pfaffl e=[10 exp (-1/slope)]..senza - 1 e quindi non capisco perchè nelle vostre formule sia così.grazie per la risposta |
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 05 luglio 2012 : 18:34:52
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Ciao Federica 81,
se la curva di diluizione dell'endogeno è perfetta, escluderei problemi di qualità di RNA (anche se è un target rappresentato al 100%). Tenderei a pensare che il problema sia nella concentrazione dei primer. Usi un protocollo validato? Io proveri a raddoppiare la concentrazione dei primer.... |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 05 luglio 2012 : 18:39:21
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Chissà se Federica dopo 5,5 anni ha risolto il suo problema...  |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2012 : 19:17:22
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Chissà se Federica dopo 5,5 anni ha risolto il suo problema...
ahahahaha, e chi se ne è accorto.... Federica dove sei????
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efficienza dei primers
Didattica
