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Autore

Discussione

valderica
Nuovo Arrivato

Prov.: Avellino

36 Messaggi

Inserito il - 07 novembre 2013 : 15:45:44

Salve a tutti

sulla base delle differenze tra i ceppi di E.Coli Top10 e BL21(DE3)e sul loro conseguente differente impiego (cloning Top10 ed espressione proteica BL21)volevo chiedervi se si pu� estrarre DNA plasmidico da BL21 con kit per miniprep. di solito per una miniprep si trasformano con DNA plasmidico le TOP10 e non le BL21 che notoriamente,invece, sono preferibili per l'espressione. perdonate l'ignoranza....grazie

0barra1
Utente Senior

Citt�: Paris, VII�me arrondissement

3847 Messaggi

Inserito il - 07 novembre 2013 : 22:00:45

Gi� fatto in passato, vai tranquilla: da BL21 si estrae tranquillamente DNA plasmidico.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

domi84
Moderatore

Citt�: Glasgow

1724 Messaggi

Inserito il - 08 novembre 2013 : 10:31:36

Mmm...i due ceppi sono molto diversi, non so se farei delle miniprep da BL21:
http://www.openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#BL21
http://www.openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#TOP10_.28Invitrogen.29

Le top10 hanno una serie di mutazioni che favoriscono la manipolazione del dna che le BL21 non hanno:
Mutation eliminating restriction of DNA methylated at the sequence CmAG or GmAC
Mutation eliminating restriction of DNA methylated at the sequence CmCGG (possibly mCG).
ecc..

Alcuni enzimi di restrizioni per esempio sono in grado di riconoscere sequenze di DNA solo NON metilate, quindi con le metilazioni potresti avere problemi di digestione...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...

valderica
Nuovo Arrivato

Prov.: Avellino

36 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2013 : 12:26:11

grazie ragazzi...
quindi la scelta di un ceppo piuttosto che l'altro non ha un'influenza diretta sulla resa finale? cio�,se estraggo DNA plasmidico da BL21 non ne ottengo di meno (o di pi�) se l'estrazione la vado a fare partendo da un pellet di TOP10? avendo dovuto usare per forza leBL21,abbiamo avuto poco prodotto finale,molto poco concentrato (16ng/microlitro)...per� forse quello dipende anche da altri fattori,tipo terreno usato o kit in s�....voi che dite?
poi,come suggerisce domi84,� meglio "operare" con TOP10 se desidero estrarre DNA plasmido per cloning (se quindi dovr� fare digestioni,ligasi...). l'unico limite quindi � questo? e non � poco in effetti dal momento che,come mi fai giustamente ricordare,"Alcuni enzimi di restrizioni per esempio sono in grado di riconoscere sequenze di DNA solo NON metilate, quindi con le metilazioni potresti avere problemi di digestione."....se volessi utilizzare il plasmide estratto per un'espressione della relativa proteina potrei avere problemi con l'espressione in s�? almeno in teoria intendo....

grazie mille per le vostre risposte

e w molecularlab