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valestellina84
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 23 febbraio 2014 : 19:04:20
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Salve a tutti,
sto facendo delle mutagenesi sito-specifiche. Dico subito che non sto utilizzando protocolli come Quickchange o similari. E il mio problema non è sicuramente l'amplificazione (PCR), che avviene con successo: ho controllato su gel elettroforesi e la dimensione degli amplificati fosse corretta e lo è. Ho usato più di una polimerasi, nello specifico PfU Turbo oppure Phusion.
Ora, quando procedo con la digestione con DpnI (per la rimozione del templato, che è metilato), tutto il DNA viene digerito, non solo quello parentale: infatti non ho più banda su gel.
Ho controllato tutte le soluzioni utilizzate e non c'è contaminazione da nucleasi. Ho anche utilizzato diversi DpnI, di cui anche uno nuovo. e il problema rimane. Mi chiedo: può essere che il buffer delle polimerasi (il PfU Turbo buffer, buffer GC e HF per Phusion) disturbi DpnI alterandone la specificità? Qualcuno ha avuto esperienza analoga? Suggerimenti?
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2014 : 21:37:06
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C'è qualcosa che non mi quadra. Puoi spiegare meglio questo passaggio:
Citazione:
non è sicuramente l'amplificazione (PCR), che avviene con successo: ho controllato su gel elettroforesi e la dimensione degli amplificati fosse corretta e lo è
Tu hai il tuo gene in un plasmide, fai la PCR sito-diretta e...
Le bande a che altezze le vedi? Come fai ad essere sicura che è il tuo aplificato?
Inoltre, quanto è lungo il tuo plasmide? |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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valestellina84
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2014 : 11:07:36
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domi84, per rispondere al tuo dubbio...
il mio plasmide è lungo 5500 bp. Amplifico tutto il plasmide blunt-end con Phusion polimerasi. Dal gel le bande sono all'altezza corretta (controllo con il template). Tratto con DpnI e poi Faccio gel-extraction.
Il problema (che fortunatamente ora ho risolto) è che DpnI in realtà non riusciva a discriminare parentale da sintetizzato, e quindi non riuscivo ad andare avanti. Non ero riuscita subito a capire il problema perchè avevamo 3 diverse vials di DpnI e con tutte il risultato è lo stesso. Quando ho provato un enzima di un altro laboratorio, il tutto è funzionato.
Mi rimane ancora il dubbio: l'enzima difettoso, vecchio etc...perchè dovrebbe aumentare la propria attività anzichè diminuirla?
Comunque, grazie dell'intervento. Fortunatamente ho risolto, le mie PCR sono andate a buon fine e ho ottenuto tutti i mutanti e costrutti che volevo. |
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