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EROTAVLAS
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
 Inserito il - 29 marzo 2014 : 14:56:33
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Buongiorno a tutti come scritto nel titolo nella discussione in questi giorni mi sono trovato di fronte ad un evento paranormale ...
Dopo aver estratto con kit commerciale DNA plasmico ottenuto da una precedente mutagenesi ed averlo quantificato allo spettrofotometro, devo dire anche soddisfatto del risultato,ho preparato un campione da inviare al sequenziamento.
Attendo il risultato del sequenziamento come un bimbo che aspetta Babbo Natale eeee...NO REAZIONE!!! Quantità/qualità del DNA insufficiente..
Pronto a far valere le miei ragioni con il servizio di sequenziamento ri-quantifico il mio campione con due strumenti diversi ottenendo risultati sovrapponibili. Decido allora di fare una verifica su gel d'agarosio...La quantità che vedo su gel è forse 1/10 di quella stimata allo spettrofotometro 
Della serie c'è ma non si vede...
Non riesco a trovare un spiegazione razionale anche considerando i valori di purezza A260/280 e A280/230 entrambi > 2...
Vi è mai capitata una cosa così strana???
Grazie a tutti
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
 Inserito il - 29 marzo 2014 : 20:25:16
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| Su gel di agarosio che aspetto ha il tuo DNA plasmidico? Non è che puoi esserti portato dietro del DNA genomico dalla purificazione? |
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EROTAVLAS
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2014 : 23:31:30
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Citazione:
Messaggio inserito da Geeko
Su gel di agarosio che aspetto ha il tuo DNA plasmidico? Non è che puoi esserti portato dietro del DNA genomico dalla purificazione?
Su gel vedo solo due bande, di diversa intensità, relative alla forma rilassata e supercoiled del mio plasmide e nessuna altra "sporcizia"...Facendo una stima approssimativa guardando il gel quello che teoricamente dovrebbe essere una quantità di dna di 1 ug a me sembra meno di 50 ng
Vorrei aggiungere che quando ho preparato il campione da miniprep ho eluito con H2Od...non se questo possa possa aver influito.. |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2014 : 15:09:30
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Hai eluito con acqua? Il bianco allo spettrofotometro l'hai fatto con l'acqua?
Di solito nei kit si usa lo specifico 'elution buffer' nello step finale, forse è per quello che hai avuto una resa bassa, magari il DNA è rimasto nella colonnina. Per la discrepanza tra gel e dosaggio non saprei, prova a usare un altro strumento per il dosaggio come il nanodrop. |
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EROTAVLAS
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2014 : 17:01:58
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Citazione:
Messaggio inserito da Geeko
Hai eluito con acqua? Il bianco allo spettrofotometro l'hai fatto con l'acqua?
Di solito nei kit si usa lo specifico 'elution buffer' nello step finale, forse è per quello che hai avuto una resa bassa, magari il DNA è rimasto nella colonnina. Per la discrepanza tra gel e dosaggio non saprei, prova a usare un altro strumento per il dosaggio come il nanodrop.
La misura del campione è stata ovviamente fatta usando come bianco l'acqua, sia usando uno spettrofotometro a cuvetta che il nano drop. Il campione andava sequenziato e quindi era necessario eluire in acqua. Comunque non credo che eluire con buffer, che è solo TE, rispetto alla sola acqua possa influire in qualche modo sulla resa..
La stranezza è proprio tra quello che vedo agli strumenti e quello su gel... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2014 : 21:34:05
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Ciao, innanzitutto le letture spettrofotometriche sono influenzate dal pH. Letture effettuate in buffer tipo TE sono più affidabili e riproducibili rispetto a letture effettuate in acqua, oltre al fatto che possono dare valori un po' diversi.
Comunque se hai ottenuto una concentrazione così elevata rispetto a quello che vedi su gel, è molto plausibile che tu abbia qualche contaminazione da DNA genomico o molto più facilmente da RNA.
Se hai del genomico vedi qualcosa che è rimasto nel pozzetto, mentre l'RNA migra abbastanza in basso nel gel, e non è visibilissimo. Hai controllato bene che non ci sia in effetti niente su gel oltre che il tuo DNA plasmidico?
Comunque in ogni caso la quantificazione su gel è più affidabile perché ti permette di vedere anche la qualità del tuo DNA, e spesso le ditte che fanno sequenziamento ti richiedono di mandare insieme ai campioni le foto del gel. Se devi mandare dei campioni a sequenziare ti convienre comunque "sempre" analizzarli su gel e possibilmente basarti su quello per quantificarlo.
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EROTAVLAS
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 31 marzo 2014 : 00:30:27
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Per darvi un idea di cosa parlo vi allego la foto del gel...Come ho già detto non riesco a vedere nulla che non sia il mio plasmide nelle due forme, rilassato e superavvolta, e niente altro...Questo risulato inoltre mi fa mettere in dubbio tutte le quantifiche che farò con il nanodrop ..
Immagine:
21,05 KB
Non potrebbe esserci qualcosa in soluzione che assorbe come il DNA ma in realtà non lo è?
A dimenticavo la lane a dx tra due pozzetti vuoti secondo la quantifica allo spettrofotometro dovrebbe contenere 900 ng di DNA???? |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2014 : 21:48:51
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| Scusa ma il gel che hai nella foto come vedi solo per metà è ancora pervaso dall'etidio, la parte inferiore si è esaurita, quindi non vedi niente anche se ci fosse qualcosa là sotto. I marker hanno corso tanto vedi? Non so se hai controllato il gel anche prima del momento della foto. In ogni caso l'RNA migra proprio laggiù in basso, magari ne avevi tanto e non ti sei reso conto della sua presenza.. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2014 : 18:12:56
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Sì infatti esattamente come dice Geeko, in quel gel non puoi vedere se c'è RNA.
Visto il tuo caso comunque la contaminazione da RNA è la cosa più verosimile, e comunque guarda che non è una cosa poi così rara.
Comunque per darti un'idea, questa è un'immagine presa da questo articolo: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406572
dove puoi vedere oltre alle due forme plasmidiche la presenza di RNA.
In ogni caso come ti dicevo è buona regola controllare "sempre" il DNA plasmidico su gel. |
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EROTAVLAS
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
 Inserito il - 04 aprile 2014 : 18:55:14
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Buonasera a tutti...grazie degli spunti interessanti..
In questo caso la risposta più semplice era anche la più corretta! Nel mio campione quantificato con il fluorimetro è stata stimata una presenza di 10 ng/uL di DNA andando a verificare poi su gel era proprio così .
Morale: i due strumenti utilizzati, dopo un indagine tra i colleghi, sono risulati poco affidabile ed in aggiunta il kit utilizzato per l'estrazione non sembra più funzionare nella maniera corretta!!
In futuro seguiro i vostri consigli: la verifica su gel, magari confrontando con un marker tipo MassRuler, sarà la mia prova del 9!!!
Grazie |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2014 : 19:14:50
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Ah beh certo, se usi il metodo fluorimetrico è sicuramente più affidabile perchè risente molto poco delle interferenze e della eventuale contaminazione da RNA.
Se lo hai a disposizione decisamente io opterei per quello per quantificare i tuoi campioni! 
L'analisi su gel ti permette comunque sempre di valutare l'integrità dal tuo campione a va bene come controllo. |
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