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Caterina86
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 23 aprile 2014 : 16:26:15
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Ciao a tutti, vi contatto perchè ho un grande dubbio riguardo alla costruzione di una retta di taratura in real time pcr.
devo mettere a punto un protocollo per la ricerca e la quantificazione di legionella pneumophila. siccome in questo caso si parla di quantificazione assoluta, ho la necessità di costruire una curva standard che comprenda dna estratto da concentrazioni note di cellule a partire da 10 alla 6 fino a 10 alla 1.
su molti articoli ho visto che per quantificare le unità genomiche di legionella si estrae il dna da una coltura, si legge l'od di tale dna e per avere una stima delle unità genomiche estratte, si divide il valore per 4,3 fg (corrispondente ad 1 unità genomica di legionella pneumophila). il problema è che in laboratorio non ho un nanodrop, ho solo uno spettofotometro con cuvette da 1 ml, e quindi non posso leggere la concentrazione di dna. in alternativa, per contare il numero esatto di cellule dalle quali andrò ad estrarre il dna, posso usare il metodo di semina su piastra delle diluizioni seriali o misurare l'od a 600 nm, ipotizzando che 1 od corrisponde a circa 10 alla 8 cellule (l'ho trovato in un articolo)??
grazie !!!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 aprile 2014 : 16:38:20
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Guarda che per leggere la concentrazione del DNA basta un qualunque spettrofotometro, mica per forza il nanodrop!
(anche perchè altrimenti prima del nanodrop nessuno avrebbe quantificato acidi nucleici!)
Ovviamente in una cuvetta da 1ml leggerai una soluzione diluita, la diluizione migliore la devi trovare anche in base alla concentrazione dei tuoi campioni, quindi magari fai delle prove.
Comunque nel caso qua è spiegato tutto: http://www.molecularlab.it/principi/calcoli-laboratorio/letture-spettrofotometro.asp
Poi puoi anche procurarti delle provette per volumi inferiori, ne esistono di fatte apposta di plastica che vanno bene per gli UV. |
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Caterina86
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 23 aprile 2014 : 16:56:07
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| e invece per quanto riguarda la quantificazione mediante semina su piastra o misura dell'od 600? sono ugualmente valide? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 aprile 2014 : 18:05:19
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Citazione:
Messaggio inserito da Caterina86
e invece per quanto riguarda la quantificazione mediante semina su piastra o misura dell'od 600? sono ugualmente valide?
Sono sicuramente molto meno valide!
Non so se il valore che hai trovato per 1 OD600, sia un valore specifico per il tuo microorganismo, perchè da un batterio all'altro cambia.
Comunque a parte questo, entrambi i metodi sono una "stima" del numero di cellule e per quanto tu possa fare una determinazione il più accurata possibile, comunque il valore che ottieni e "N. di cellule". Poi però da queste tu estrai il DNA e non è detto che l'efficienza della tua estrazione sia del 100% e ancor peggio, non è detto che sia la stessa ogni volta che ripeti l'esperimento.
Se non hai alternative, puoi anche farlo, ma sicuramente è una misura meno accurata. Io punterei di più sul cercare di determinare la concentrazione di un campione di DNA per fare la curva standard. |
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curva standard per real time pcr
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