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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
 Inserito il - 06 marzo 2007 : 15:08:10
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Ciao a tutti!
Da qualche tempo sto litigando con la PCR per l'amplificazione di un segmento GC rich (non è una mia scelta e non ho alternative)
Dopo una serie di tentativi sono riuscita ad ottimizzare una PCR con risultati quasi accettabili...aggiunta di DMSO in concentrazione finale 5% e a mettere un eccesso di un primer rispetto all'altro 1:6...non contenta il ciclo della PCR è un touchdown...il problema è che continuo ad avere un aspecifico a circa 1000bp oltre alla mia banda assolutamente splendida a 400bp...qualcuno sa come giocare col ciclo della touchdown?il ciclo non è qllo tradizionale (ve l'avevo detto che sto facendo una cosa impossibile, no?)ma all'inverso...cioè:
95°C 1'
95°C 30''
63°C 30'' 15 cicli
72°C 1'10''
95°C 30''
63°C-53°C 30'' 20 cicli
72°C 1'10''
Grazie mille a chi ha qualche idea... Chiara
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Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
 Inserito il - 06 marzo 2007 : 16:08:35
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Ma hai provato con il touchdown classico?
Messo cosi secondo me quel programma non ha tanto senso, perche dopo i primi 15 cicli a 63 C secondo me nella tua reazione hai gia' l'aspecifico.. E nei cicli successivi non fai altro che aumentarne la quantita', visto che la temperatura diminuisce.
La teoria dietro al touchdown e' che i primi (pochi!!) cicli ad alta temperatura permettono l'amplificazione di (poco) prodotto specifico.. I cicli successivi (ad una temeratura minore) ne aumentano la quantita'.
Per ottenere alta specificita' nella reazione e' necessario che i primi cicli abbiano condizioni molto stringenti (quindi alte temperature). E'un passaggio critico perche qualsiasi prodotto dei primi cicli verra' amplificato enormemente successivamente.
Perche non fai un touchdown classico, con i primi 5 cicli con temperatura di annealling da 69 a 64 C, poi fai 30 cicli a 63 C.
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 06 marzo 2007 : 16:27:27
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Ho già preso in considerazione la touchdown tradizionale...una vera tragedia...il nulla di nulla...ma proprio nulla...
Con questo ciclo sono riuscita ad eliminare altri 3 aspecifici...sfortunatamente continuo a trascinarmi questo...
Ti dirò...la prima volta che ho ottenuto questo risultato il mio capo e la mia collega hanno deciso di sequenziare il frammento...incredibilmente la sequnza è venuta benissimo oltre che inaspettatamente pulita...loro si sarebbero pure accontentati (la mia collega tentava di far venire la PCR da un paio di mesi e noi dovevamo refertare il paziente...) io sono una rompi scatole e prima di ufficializzare il protocollo vorrei togliere ogni tipo di problema...
Cmq tenterò con il tuo suggerimento...il paziente non ha mutazioni e l'allarme è rientrato...ma qdo mi fisso su una cosa...
Grazie ancora!Chiara |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 06 marzo 2007 : 16:38:50
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Ah ah, allora ormai e' una sfida personale 
In bocca al lupo e tienici informati!
Ciao ciao |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
 Inserito il - 06 marzo 2007 : 16:46:58
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Più che una sfida una guerra
ora ho trovato in rete anche articoli in cui citano la combinazione micidiale DMSO 10% (già provato con tutto quel DMSO non viene manco l'aspecifico..) e betaina...tra un po' ci sputo dentro
Comunque grazie mille Valia |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 marzo 2007 : 19:02:19
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Io non sono mai andata d'accordo con la Touch Down!
Comunque hai provato a variare anche i tempi di allungamento???
Se il tuo prodotto specifico è 400bp e l'aspecifico è maggiore (1000bp), puoi provare anche con un tempo di allungamento inferiore ad. es 30 sec. che sono sufficienti per ultimare l'allungamento della banda da 400bp!
In bocca al lupo!!! |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 07 marzo 2007 : 12:27:51
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Grazie del suggerimento GFPina ma purtoppo ci avevo già provato...diminuento il tempo di elongation un'altra volta PCR bianca...
Cmq tra ieri e oggi ho giocato con la mia PCR ancora un po'...calando i cicli durante il decremento di temperatura la PCR viene da benissimo e...NESSUN ASPECIFICO!
Ora siamo pronte a rifare la PCR sul nostro paziente (ovviamente fino ad ora ho usato un DNA di controllo...il mio...)e a sequenziarlo nuovamente! EVVIVA!
E ora pronta nuove avventure...dovrei riprendere il mio lavoro con le proteine...
Baci e grazie! Chiara |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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Touchdown PCR
Didattica
