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BIOUNI
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4 Messaggi |
 Inserito il - 18 novembre 2014 : 23:48:13
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salve a tutti, qualcuno potrebbe spiegarmi quanto sotto?
purified DNA products
-150-300pb: 2ng/microlitri in 15 microlitri totali (includendo 15pmol di primer)
-300-1000: 5ng/microlitri...
>1000: 10 ng/microlitri...
sono le indicazioni per spedire campioni da sequenziare.
grazie
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midichloria
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75 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2014 : 13:25:24
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Se il tuo DNA che vuoi sequenziare é lungo tra le 150 e le 300 bp, devi inviarne 15 uL, ad una concentrazione di 2ng/uL (quindi se hai una concentrazione maggiore, lo devi diluire opportunamente) e devi aggiungere i primers ad una concentrazione 15pmol.
Stesso ragionamento per gli altri prodotti di dimensioni differenti.
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BIOUNI
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4 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2014 : 20:19:52
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vediamo se il mio ragionamento fila: supponiamo che io abbia una banda di 500 pb che pesa 97 ng (ho caricato 5 ul di campione x la corsa elettroforetica), quindi avrei 19,4 ng in 1 ul; dovendo inviare il campione ad una concentrazione di 5ng/ul, diluisco 1:4 il campione. E il primer deve stare nei 15 ul totali? quindi quanto campione e quanto primer???  |
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midichloria
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75 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2014 : 12:33:44
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Se diluisci il campione 1:4, ti trovi ad avere 19,4 ng in 4 uL (cioé una concentrazione di circa 5ng/uL in 4uL totali).
Ma loro richiedono 5 ng/uL in 15uL totali.... in pratica sono 75ng di DNA.
Dato che la tua concentrazione iniziale é di 19,4 ng/uL, per avere 75 ng devi prelevare 3,86 uL del tuo campioni iniziale e aggiungere i primers e in seguito acqua fino ad arrivare a 15uL.
Per quanto riguarda i primers, tutto dipende dalla concentrazione iniziale dei tuoi primers... 100uM? 10uM? Sapendo la tua concentrazione iniziale di primer basta calcolare quanto diluire i primer per avere, ad esempio, una concentrazione 15pM, in modo da dover prelevare solo 1uL della diluizione di primer e aggiungerlo al tuo campione da inviare. |
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BIOUNI
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4 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2014 : 15:29:37
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ora è tutto chiaro, grazie infinite  |
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