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Lia79
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 09 dicembre 2014 : 14:35:46
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Ciao!!!
Ho disegnato diverse coppie di primers che a breve arriveranno (spero!!!). Al loro arrivo dovrò testarli in modo da capire quali coppie amplificheranno e quali no. Come fare? PCR? Ci sono particolari accorgimenti cui prestare attenzione?
Help me, please!
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midichloria
Nuovo Arrivato
75 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2014 : 15:21:31
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Ciao! Devi usare i primers per amplificare una sequenza? Hai giá calcolato le temperature di melting dei vari primers? Sono temperature che non differiscono di piú di 5ºC? Hai controllato se i primers formano hairpins o hanno regioni che possono causarne l'appaiamento tra di loro?
Puoi controllare se i primers funzionano e qual'é la temperatura ottimale di annealing dei primers con la tua sequenza facendo una PCR. La temperatura di annealing da utilizzare di solito é corrispondente alla temperatura di melting meno 5ºC. Se per esempio hai due primers con Tm di 59ºC e 61ºC, usare una temperatura di annealing di 56ºC di solito da buoni risultati. |
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Lia79
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2014 : 10:22:24
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Grazie!!!
Nella scelta dei primers ho semrpe cercato di evitare quelli che, da impostazioni teoriche del programma, potessero dare dimeri e Hairpins. Le temperature di melting, poi, poichè i primers li ho progettati per poter lavorare in multiplex, sono tutte intorno ai 59°C. |
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test di amplificazione primers
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