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Uther
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Na
35 Messaggi |
 Inserito il - 09 dicembre 2014 : 16:13:57
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Buonasera a tutti!
Ho controllato che l'argomento non sia stato toccato in passato, per cui posso farvi questa domanda 
Sto facendo un esperimento di COIP.
La domanda è: avete mai caricato una certa quantità di anticorpo (+ Laemmli) un pozzetto di un gel per SDS PAGE per utilizzarlo come controllo?
Ut
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
 Inserito il - 09 dicembre 2014 : 19:43:49
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Perché? A cosa ti serve tale controllo? Hai delle bande delle tue proteine vicine a quelle dell'anticorpo e riveli con un anticorpo della stessa specie di quello che hai usato per l'IP?
Comunque mai usato come controllo per la IP, le bande dell'anticorpo si riconoscono comunque (50 e 25KDa in condizioni riducenti), però ho seminato diverse volte anticorpi in SDS-PAGE. |
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Uther
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Na
35 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2014 : 11:06:26
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Ciao GFPina 
La banda di mio interesse è esattamente a 50 KDa.
No l'anticorpo con cui rivelo non è della stessa specie, ma comunque vedo il segnale.
Ti do giusto due dettagli.
La proteina di suo banda a 50; può essere Sumoilata e Ubiquitinata in più posizioni.
Ho immunoprecipitato con un anticorpo per la proteina tal quale e rivelato per alfa-SUMO.
In una precedente IP rivelando per SUMO ho le bande ad alto peso che mi interessano, ma ho anche una discreta banda a 50 KDa. Mi serviva un modo per poter dire se la banda che vedo a 50 è costituita dalla proteina non sumoilata (che per qualche motivo viene vista dall'alfa-SUMO) oppure erano le catene pesanti dell'anticorpo.
HO ripetuto l'IP e ho caricato come controllo 1 gamma dello stesso anticorpo che uso per immunporecipitare; ho rivelato con alfa-SUMO e vedo le catene pesanti identiche nella lane controllo e nella lane di IP.
Ma l'anticorpo per IP è rabbit, l'alfa SUMO è mouse!
Non ho a disposizione il kit di lavaggio che consente di crosslinkare le catene degli anticorpi e di buttarle giù con i lavaggi, per cui mi hanno consigliato questo controllo e volevo capire meglio.
Tu hai detto di non averlo mai fatto, quindi deduco che non si tratti di una procedura di routine.
E' normale che un alfa-Mouse veda le catene di un alfa-Mouse così nitidamente?
Suggerimenti tecnici?
Ut |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2014 : 16:45:46
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Citazione:
Messaggio inserito da Uther
No l'anticorpo con cui rivelo non è della stessa specie, ma comunque vedo il segnale.
Citazione:
E' normale che un alfa-Mouse veda le catene di un alfa-Mouse così nitidamente?
Anche se i due anticorpi sono di specie diversa l'anticorpo secondario che utilizzi in WB può vedere le Ig dell'altra specie. La cosa è abbastanza comune.
A me è capitato varie volte che un anti-mouse vedesse IgG umane o di coniglio.
In genere il controllo che si fa è quello di sviluppare lo stesso WB anche con solo l'anticorpo secondario, in modo da escludere le bande (tra cui ci dovrebbero essere anche le IgG) riconosciute dal secondario. Nessuno però ti vieta di includere un pozzetto con solo l'anticorpo come controllo.
Il problema però è che se la banda della tua proteina è sovrapposta a quella delle IgG comunque viene mascherata e non la vedi.
La cosa migliore sarebbe cambiare secondario, usare ad es. un anticorpo secondario altamente purificato che non cross-reagisca con Ig di altre specie (non è facile trovarne uno buono) oppure esistono anche anticorpi che riconoscono le IgG solo in forma nativa, quindi funzionano bene come secondari per il WB ma non vedono le Ig blottate sulla membrana, es. http://www.abcam.com/veriblot-for-ip-secondary-antibody-hrp-ab131366.html
Un altra possibilità è quella di utilizzare una eluizione con glicina anziché con Laemmli. Anche se... bisogna vedere se con la tua proteina funziona e in parte l'anticorpo se non è cross-linkato si potrebbe comunque staccare dalle biglie.
Alternativamente poi dare un'occhiata a questo protocollo: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21448433 |
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Uther
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Na
35 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2014 : 18:34:20
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Tutto molto chiaro.
Grazie mille per il tuo tempo ed i tuoi consigli  |
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Pozzetto di anticorpo come controllo
Didattica
