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murphy
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 15 luglio 2015 : 17:05:26
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Salve a tutti,
avrei una domanda :)
Qualcuno saprebbe spiegarmi come seleziono, dopo ibridazione tra cellule somatiche interspecifiche, gli ibridi ? In altre parole, il funzionamento del terreno HAT.
Ho letto molti appunti e guardato sul web, ma niente mi sembra abbastanza completo.
Spero qualcuno possa aiutarmi.
Grazie mille in anticipo
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prion
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 17 luglio 2015 : 15:47:14
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Si usa una linea cellulare immortale (es. mieloma) in cui le cellule mancano di un enzima che si chiama ipoxantina-guanina-fosforibosil trasferasi (HGPRT), in alternativa possono essere mutate nel gene che codifica per la timidin chinasi (TK). HGPRT è necessario per la sintesi delle basi puriniche (per la sintesi di dATP e dGTP) a partire da ipoxantina, mentre TK è necessario alla sintesi della base pirimidinica dTTP a partire dalla timidina; entrambe sono necessarie quando il pathway di sintesi principale è bloccato dal farmaco aminopterina.
Il terreno HAT contiene sia il farmaco, che ipoxantina e timidina.
Io ho studiato nel caso specifico per la creazione di ibridomi... Si uniscono cellule B a cellule ingegnerizzate per essere mancanti di TK o HGPRT.
Va stimolata la fusione cellulare (si usa un agente fusogeno come il glicole polietilenico):
- Cellula B + cellula mancante (immortale, è una cellula di mieloma) = ibridoma: è immortale come la cellula di mieloma ma possiede TK (o HGPRT) come la cellula B. Sopravvive.
- Cellula B (non fusa o fusa) = sopravvive perché possiede gli enzimi, ma per un tempo determinato.
- Cellula mancante (non fusa o fusa) = non sopravvive in presenza di aminopterina perché non è intraprendibile la via di salvataggio.
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