| Autore |
Discussione |
|
|
girlA
Nuovo Arrivato
Città: napoli
46 Messaggi |
 Inserito il - 09 ottobre 2015 : 16:13:40
|
salve ragazzi...
risorro alle vostre conoscenze e alle vostre esperienze perchè sto uscendo pazza!!! sto facendo una purificazione di un anticorpo da siero( specifico per una certa proteina che mi sono fatto fare) usando un protocollo su PVDF. l'anticorpo mi serve poi per un' immunoprecipitazione e così com'è dicono che non va bene!!
il protocollo che uso prevede un western classico fino all' incubazione con l' anticorpo primario che è qll che poi devo purificare... dopo di che vi riporto proprio i passaggi del protocollo:
9. Elute the antibody by incubating the membrane with 1-2 ml 100 mM Glycine (pH 2.5) for 2 min.
10. While incubating, add 75 #956;l-100 #956;l 2 M Tris-HCl (pH 8.5) to tubes. The volume should allow a final concentration of 150 #956;M Tris after step 11.
11. After 2 min, add 1-2 ml of the eluted antibody in glycine from step 9 to the tubes from step 10. The Tris (pH 8.5) should neutralize the acidic glycine.
12. Repeat step 9-11 for three times.
13. Dialyze
Fatti tutti questi passaggi devo testare l' anticorpo e quando uso pe fare un' altro western non si vede assolutamente nulla!!!!!
è come se l' anticorpo primario che devo purificare non si staccasse proprio dal filtro.. infatti ho poi provato a trattare con un secondario la PVDF che avevo usato per purificare l' anticorpo e ho segnale..a dimistrazione del fatto che il primario è ancora lì... e nelle mie eluizioni fatte con glicina non ho assolutamente nulla!!!!
a questo punto mi chiedo..cosa non va??perchè l'anticorpo non si stacca??? aiuto vi prego...
|
|
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2015 : 19:20:11
|
Mai sentita una eluizione da PVDF!
Ma fare invece una cromatografia?
Comunque, domanda stupida (ma non si sa mai!) il tris l'hai messo in una provetta a parte vero? Non assieme alla glicina sulla membrana.
Poi potresti provare ad aumentare il tempo di incubazione, magari 2 min. non sono sufficienti. |
 |
|
|
girlA
Nuovo Arrivato
Città: napoli
46 Messaggi |
 Inserito il - 09 ottobre 2015 : 22:24:08
|
 Scritto da MolecularLab Mobile
GFPina l ho messo sia in provetta ke sulla membrana assieme alla glicina ma nnt....
Una cromatografia..ho visto vari protocolli ke usano la proteinaA x legare l anticorpo. .ke dici?? Mai fatto qst tipo di protocollo? ? |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2015 : 17:27:36
|
Allora, se hai messo il tris assieme alla Glicina sulla membrana, per forza non è funzionato!
Il funzionamento di tutto il processo è questo:
La glicina che si utilizza è a pH acido (2.5) e serve per competere con il legame dell'anticorpo all'antigene. A pH acido l'anticorpo lega male l'antigene e quindi tende a staccarsi, quindi... dovresti trovartelo in soluzione.
Dopo l'incubazione delle tua membrana con glicina, quindi l'anticorpo si trova in soluzione, ma è una soluzione acida che "non fa bene" all'anticorpo (si rovina e potrebbe anche non funzionare più), per questo motivo devi "neutralizzare" la soluzione al più presto. Per neutralizzare utilizzi una soluzione di Tris basica che devi aggiungere "immediatamente" dopo aver recuperato la tua soluzione di glicina contenente l'anticorpo.
Per farti fare una cosa rapida, il tuo protocollo ti dice:
preparati già le provette dove recupererai la tua soluzione di glicina contenente l'anticorpo e metti in queste provette la soluzione di tris, così appena ci metti dentro la soluzione che recuperi dalla membrana il pH si neutralizza subito!
Ora, se tu metti il tris subito in incubazione assieme alla glicina, il pH è neutro e l'anticorpo se ne sta bello legato al tuo antigene!
Se invece hai fatto un'incubazione delle membrana con "solo" glicina, allora almeno in parte il tuo anticorpo dovrebbe essere andato in soluzione. Magari puoi provare ad aumentare i tempi per vedere se riesci a staccare l'anticorpo.
Altrimenti puoi provare con una cromatografia.
La cosa migliore è fare una cromatografia di affinità con la tua proteina, perché così isoli solo l'anticorpo che lega la tua proteina. Il meccanismo è più o meno lo stesso di quello che hai fatto con PVDF. Dovresti però prepararti tu una colonna coniugando la tua proteina.
Puoi anche fare una cromatografia su proteina A o su proteina G e in questo caso isoleresti anche altri eventuali anticorpi presenti nel tuo campione. Ma comunque puliresti il campione da tutto il resto. Per questo dovrebbero esserci delle colonne anche già preparate, e comunque sia puoi comprarti la resina, senza dover coniugare tu la proteina. |
|
|
|
girlA
Nuovo Arrivato
Città: napoli
46 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2015 : 13:07:13
|
Scritto da MolecularLab Mobile
Frs nn mi sn spiegata bn scusami..nn metto glicina e tris insieme sulla membrana ma..metto prima la glicina sulla pvdf e dp metto il tris smp sulla pvdf x neutralizzare e raccolgo il tt..ma nnt!! poi ho provato a fare separatamente ovvero mettere la glucina..rimuovo e aggiungo in provetta cn il tris..ma nnt lo stesso..
Dv provare frs ad aumentare il tmp della glicina..frs l anticorpo..si lega mlt saldamente!!!e ha bisogno di più tmp..ke dici?? Altrim provo una cromatografia..
Grazie mille cmq GFPina..
Dv frs aumentare i tempi della glicina.. |
|
|
| |
Discussione |
|
purificazione anticorpo su PVDF
Didattica
