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chiara_g
Nuovo Arrivato
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 Inserito il - 24 marzo 2016 : 15:53:43
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Buongiorno a tutti!
Avrei una domanda per quanto riguarda la realizzazione di una curva di crescita di cellule tumorali.Ho seminato queste cellule in multiwell da 0,2 cm2 e poi trasfettate con dei plasmidi per vedere l'effetto sulla crescita appunto,di alcuni enzimi.Il problema è stato però che andando a contare a 24h e 48h le cellule erano pochissime,meno di quelle seminate (3000 per pozzetto).Questa curva era già stata precedentemente realizzata sulla stessa linea cellulare,sempre trasfettata con gli stessi plasmidi.La volta precedente addirittura erano state seminate 2400 cellule per pozzetto,e già il giorno dopo erano arrivate intorno alle 10.000.Questa volta invece,perfino lo scramble,che dovrebbe soltanto crescere esponenzialmente,è passato dalle 3000 iniziali alle 1050 circa,le altre cellule invece trasfettate ancora peggio,alcune sono scese da 3000 a 750.Cosa può essere successo?Non è la prima volta che semino e trasfetto per fare una curva di crescita,applico sempre lo stesso metodo e le altre curve sono sempre venute bene.L'unica cosa che mi viene in mente è questa:per questa curva ho seminato delle cellule che avevo ricongelato,dopo averle utilizzate,a febbraio di quest'anno,quindi le ho riscongelate dopo poco tempo,ma il guaio è stato che,quando le ho ricongelate a febbraio,sbagliando,le ho messe immediatamente in azoto liquido,invece che farle stare per un pò a -80 gradi.Penso di averle in qualche modo "shockate"..potrebbe essere stato questo il problema?Le ho in qualche modo indebolite troppo quindi i 6-8 minuti in tripsina che servono per staccarle sono bastati per romperle?Anche perchè facendo la conta con il trypan blu non ho osservato cellule morte..cosa mi dite?Grazie mille :)
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Curva di crescita
Didattica
