Problema con inibitore poco solubile e poco attivo

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Smichel
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36 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2016 : 19:31:15

Ciao a tutti,
Oggi vi espongo il mio problema con un inibitore abbastanza rompino.
I dovrei calcolare la IC50 di un inibitore analogo del substrato di un enzima che perÃ² Ã¨ poco solubile. La massima solubilitÃ che sono riuscito a ottenere in tampone di reazione (Hepes 50 mM pH 7)Ã¨ di 1 mM.
Il problema Ã¨ che non riesco a ottenere una inibizione decente a questa concentrazione utilizzando una concentrazione di substrato di circa 100 uM (considerate che la Km dell'enzima Ã¨ 45 uM). infatti ottengo una inibizione di circa il 10%.
Io ho eseguito delle misurazioni dopo 10 minuti di incubazione ottenendo il 30% del prodotto nella reazione senza inibitore.
Ho pensato che potrei ridurre ancora il substrato, ma non bisognerebbe rimanere sopra la Km?
Inoltre io devo poter vedere il prodotto in HPLC e sotto una certa quantitÃ non riesco a rilevarlo.

Cosa posso fare? Sto sbagliando qualcosa di concettuale?

Vi prego aiutatemi.

Spero di essere stato chiaro.