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massimo_santoro
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
19 Messaggi |
 Inserito il - 03 maggio 2007 : 13:05:06
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Ciao a tutti,
ho un questione da sottoporvi. Sto studiando una proteina muscolare che in condizioni patologiche si lega a delle sequenze ripetute presenti nel 3'UTR di un mRNA, tanto questo mRNA non viene trasportato nel citoplasma e resta nel nucleo dove forma dei foci con questa proteina.Sto facendo dei western blot su estratti totali di proteine da biopsie muscolari congelate. La mia questione è in questi omogenati dove c'è un pò di tutto la proteina resta comunque legata all'RNA o in parte si stacca. Io su western ho due bande una della dimensione attesa e una più alta di uguale intensità. Come possso spiegare questa cosa. Lo so che bisognerebbe fare gli estratti nucleari e citoplasmatici, ma su biopsie muscolari congelate la resa è molto bassa e non ho trovato dei kit per poterlo fare. se avete suggerimenti vi sarei molto grato...
ciao
Massimo
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2007 : 22:44:17
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Un paio di cose che mi vengono in mente:
1) Se non riesci a fare gli estratti nucleari potresti fare un'immunoistochimica per mostrare che la proteina è localizzata nel nucleo, anche se poi far vedere che è legata all'RNA potrebbe essere dura.
2) Se la proteina forma aggregati può essere che la banda a peso più alto sia un dimero o un complesso che non viene distrutto dall'SDS?
3) Se sospetti che l'altra banda possa essere un'altra proteina hai a disposizione una MALDI o simile potresti tagliare le 2 bande dal gel e sequenziarle per vedere cosa sono... ma magari questa sarebbe una perdita di tempo e $.
4) L'estrazione differenziale delle proteine nucleari dovrebbe essere più semplice sul tessuto fresco, non hai la possibilità di accedervi?
(conta che sono le 8.30 del mattino e il caffè non è ancora pronto... quindi perdona eventuali scemenze scritte!  ) |
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proteine da biopsie muscolari
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