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carmilla983
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 Inserito il - 07 giugno 2007 : 18:05:39
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ciao a tutti!faccio il secondo anno della lm di Biologia sanitaria a torino. ho appena saputo che dovrò affrontare una prova di esame eseguendo una quantificazione del DNA e seguente elettroforesi.
a lezione in lab non è mai stata fatta vedere la quantificazione del DNA quindi non ho neanche uno straccio di protocollo in mano , c'è qualcuno che potrebbe darmi un'indicazione?sono disperata. dovrebbe essere mediante spettrofotometro ma non ho veramente idea di come partire...aiutateme!
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marilena76
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Prov.: Bari
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8 Messaggi |
 Inserito il - 07 giugno 2007 : 18:53:41
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ciao sono marilena. ho svolto la tesi in biochimica, vegetale x giunta, xò ho eseguito una estrazione del DNA. Posso solo dirti che il DNA si dosa a 260 nm. si esegue una diluizione e si fa la lettura allo spettrofotometro. Sapendo che 50 microgrammi/ml di DNA hanno assorbanza ca. 1 e considerando il fattore di diluizione, ti ricavi la concentrazione di DNA del tuo estratto.
Ciao  |
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GFPina
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8408 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2007 : 19:10:58
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Beh in questo post trovi delli indicazioni su come si esegue il calcolo:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=3199
Per il protocollo basta diluire il DNA in acqua sterile in genere (oppure in un tampone) e metterlo in una cuvetta per lo spettrofotometro.
- Prima leggi il "Bianco" cioè l'acqua che utilizzi per diluire il campione: metti l'acqua in una cuvetta da spettrofotometro e lo leggi, in genere con questo puoi tarare le strumento come "Bianco" che avrà una assorbanza pari a zero.
- Poi leggi la cuvetta in cui c'è il tuo campione
Spero sia chiaro
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carmilla983
Nuovo Arrivato
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59 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2007 : 19:18:50
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quindi non devo costruire rette di taratura o cos'altro vero?perchè alcuni miei colleghi parlavano di questo...
per fare il bianco che diluizione potrei usare?devo sperare che le diluizioni mi siano fornite al momento dell'esame?
i prof mi forniranno i campioni da leggere. come faccio a sapere le diluizioni?
grazie mille, siete davvero di aiuto!  |
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GFPina
Moderatore
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Inserito il - 07 giugno 2007 : 19:33:04
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Beh non so cosa ti forniranno all'esame, quindi non so bene come aiutarti.
Per il bianco non devi fare nessuna diluizione, lo usi indiluito (l'importante è che sia quello in cui è stato diluito il DNA).
In pratica per vedere la concentrazione di un campione leggi l'assorbanza del campione a cui sottrai quella del "diluente", tarando lo strumento sul bianco leggi solo la assorbanza del campione!
La retta di taratura in realtà non serve basta fare i calcoli che trovi nell'altro post!
Lo spettrofotometro di da un valore in OD e da questo ricavi la concentrazione.
Se ti danno dei campioni già diluiti presumo che ti dicano la diluizione, altrimenti non puoi calcolare la concentrazione. |
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fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2007 : 19:33:09
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ma la retta di taratura non serve per il bradford?con quello leggi direttamente la quantità in mg...
per la lettura allo spettofotometro quello che ottieni sono le concentrazioni dei campioni..ho fatto la tesi due anni e mezzo fa e ne son passati di fiumi sotto ponti da allora,ma per quel che ricordo il bianco è il buffer dove poi diluisci il tuo campione..ad es PBS,100 microlitri li metti in cuvetta e premi blank.
A quel punto tutto ciò che misuri poi il pc lo misurerà in riferimento a questo standard.
LE diluizioni io mettevo in genere 10 microlitri di campione e 90 microlitri della soluzione con cui hai fatto il biancooppure 2 microlitri e 98 microlitri,ma forse è meno preciso.
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carmilla983
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Inserito il - 07 giugno 2007 : 19:40:45
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vero anche per me la retta non c'entrava nulla!
io metto il bianco e poi leggo i miei campioni. l'assorbanza che trovo la uso direttamente per trovare la concentrazione di DNA giusto?non dv sottrarre nulla
se i campioni non sono diluiti, come faccio o è impossibile che non siano diluiti? |
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GFPina
Moderatore
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Inserito il - 07 giugno 2007 : 19:49:30
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Se lo spettrofotometro (cosa che in genere fa!) ti fa tarare il bianco (quindi lo legge come assorbanza zero), non devi sottrarre nulle altrimenti divresti sottrarre l'assorbanza del bianco!
Se non sono diluiti... o li fanno diluire a te, oppure in teoria puoi anche leggerli così, presumo che ti daranno comunque una soluzione per fare il bianco che dovrebbe essere il buffer (o acqua) in cui è sciolto il DNA! |
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fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2007 : 21:21:39
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si,il bianco lo sottrae automaticamente lui in genere..
per quanto riguarda la diluizione non ho ben capito...il dna è diluito perchè è sciolto,quindi di quello che hai nella eppendorf...ora sto solo ipotizzando,servirebbe altro parere... presumo tu prelevi un volume (es quello che ho detto sopra) e lo diluisci nel buffer o soluzione che usi,risospendendolo nella cuvetta e metti a leggere nello spettrofotometro.Sembra un gran casino ma la cosa è abbastanza lineareperchè fa tutto la macchina,devi solo evitare di sputare nella cuvetta o prelevare con la puntina gialla della pipetta con diecimila gocce sulla parte esterna,solo un pò di accuratezza,risospendere bene l'intero volume così non si una lettura falsata e poi premi sample e ti vien fuori la lettura.
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GFPina
Moderatore
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Inserito il - 08 giugno 2007 : 01:10:09
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Citazione:
Messaggio inserito da fpotpot
per quanto riguarda la diluizione non ho ben capito...il dna è diluito perchè è sciolto,quindi di quello che hai nella eppendorf...ora sto solo ipotizzando,servirebbe altro parere... presumo tu prelevi un volume (es quello che ho detto sopra) e lo diluisci nel buffer o soluzione che usi,risospendendolo nella cuvetta e metti a leggere nello spettrofotometro.
Si il DNA è sciolto nella provetta ad una determinata concentrazione. In genere per leggere la concentrazione ne prendi un pochino ad es. come dicevi prima 10ul in 100 (quindi 10 + 90 di diluente) e lo leggi allo spettrofotometro. Nessuno ti vieta però di leggere il campione indiluito (esistono apposta anche delle cuvette sterili monouso da cui puoi recuperare il campione!)
Non so come si svolgerà esattamente la prova d'esame, ma la cosa più probabile è che ti facciano leggere il campione diluendolo (come in genere si fa!)
Spero sia tutto chiaro!
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carmilla983
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Inserito il - 08 giugno 2007 : 13:37:50
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| se mi dessero il campione di DNa senza diluizione e dovessi proporne una io, cosa potrei fare? c hanno detto che saranno due campioni, un controllo ed un trattato che saranno poi sottoposti a corsa elettroforetica quindi.. |
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GFPina
Moderatore
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Inserito il - 08 giugno 2007 : 16:45:58
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Allora bisognerebbe anche vedere da quanto sono le cuvette che usi e quant'è il minimo volume che può leggere lo spettrofotometro.
In ho un apparecchio che legge anche 50ul quindi diluisco 1ul di DNA in 50, mi ricordo che per la tesi usavo un vecchio spettrofotometro e diluivamo 5 o 10ul in 1 ml.
Ovviamente se la diluizione è maggiore la lettura è meno accurata. |
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carmilla983
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Inserito il - 26 giugno 2007 : 16:03:27
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ancora qualche domandina...
- Com'è la formula del grado di purezza? quali operatori tra (A260 ? A320) / (A280 ? A320) ?
- I campioni devono essere fatti in doppio, ossia devo fare 1 bianco, 2 controlli e 2 trattati (quindi 5 provette) oppure devo leggere 2 volte il controllo e 2 volte il trattato? devo poi fare la media dei risultati ottenuti per poter utilizzare la formula che correla assorbanza e concentrazione?
- Sempre nella formula tra assorbanza e concentrazione per il dna, il fattore di diluizione è 1/ (fratto) X?
grazie mille  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
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Inserito il - 26 giugno 2007 : 19:08:09
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Citazione:
Messaggio inserito da carmilla983
- Com'è la formula del grado di purezza? quali operatori tra (A260 ? A320) / (A280 ? A320) ?
A260/A280 = vedi la contaminazione da proteine
questo rapporto dovrebbe essere maggiore o uguale a 1,7-1,8
A260/A230 = vedi la contaminazione da carboidrati e fenoli
questo rapporto dovrebbe essere circa 2.2
A volte si fa anche la lettura a 320 nm: a questa lunghezza d'onda non assorbono nè acidi nucleici nè proteine quindi l’assorbanza dovrebbe essere zero. Comunque deve essere il 5% della assorbanza a 260nm altrimenti vuol dire che il campione (o la cuvetta) è molto sporco e non puoi fare una lettura accurata.
La formula che dici tu dovrebbe essere:
(A260 - A320) / (A280 - A320)
in quanto consideri l'assorbanza a 320nm come background e la sottrai alle assorbanza a 260 e 280.
Citazione:
- I campioni devono essere fatti in doppio, ossia devo fare 1 bianco, 2 controlli e 2 trattati (quindi 5 provette) oppure devo leggere 2 volte il controllo e 2 volte il trattato? devo poi fare la media dei risultati ottenuti per poter utilizzare la formula che correla assorbanza e concentrazione?
io personalmente faccio più letture dello stesso campione... non so cosa vogliano che tu faccia però
Citazione:
- Sempre nella formula tra assorbanza e concentrazione per il dna, il fattore di diluizione è 1/ (fratto) X?
No è X non 1/X!
Tu stai leggendo una soluzione diluita, quindi la lettura sarà inferiore che non se fosse una soluzione concentrata. La soluzione "madre" di cui vuoi conoscere la concentrazione è più concentrata quindi con i calcoli devi ottenere un risultato maggiore.
Ad es. hai diluito 10ul in 100ul (fattore di diluizione = 10)
il tuo calcola sarà:
A260 x 50 x 10
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carmilla983
Nuovo Arrivato
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59 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2007 : 13:03:30
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giovedì ho fatto l'esame...grazie a tutti, i vostri consigli sono stati preziosi e sono riuscita a fare tutto quello che c'era scritto nel protocollo. mi è rimasta una curiosità:facendo i dovuti calcoli ho trovato una concentrazione di 2937,5 ug/ml di DNA nella mia provetta.
Nel protocollo dovevo diluire se necessario affincheè la mia provetta avesse una concentrazione di 2 ug/ml. io n l'ho fatto perchè n mi pareva necessario ho fatto bene?
mi hanno fatto fare comunque il calcolo, come dovevo procedere? il volume finale ho assunto fosse di 8 ul. io ho fatto qualcosa ma volevo sapere se ho ragionato giusto! |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2007 : 14:38:34
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che bella cosa il nanodrop |
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carmilla983
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Inserito il - 01 luglio 2007 : 16:04:49
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che sarebbe??scusami ma cosa c'entra con quello che ho chiesto?
qualcuno sa che volume dovrebbe venire? |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2007 : 20:45:53
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| e' un simpatico spettrofotometro al quale dai una goccia del tuo campione e fa tutto lui, liberandomi dall'incubo delle cuvette! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2007 : 23:59:27
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Bene!!! Sono contenta che l'esame sia andato!!!
Citazione:
Messaggio inserito da carmilla983
... mi è rimasta una curiosità:facendo i dovuti calcoli ho trovato una concentrazione di 2937,5 ug/ml di DNA nella mia provetta.
Nel protocollo dovevo diluire se necessario affincheè la mia provetta avesse una concentrazione di 2 ug/ml. io n l'ho fatto perchè n mi pareva necessario ho fatto bene?
mi hanno fatto fare comunque il calcolo, come dovevo procedere? il volume finale ho assunto fosse di 8 ul. io ho fatto qualcosa ma volevo sapere se ho ragionato giusto!
... però non ho capito bene la domanda!!!
Eh!!! Ad avercelo questo fantomatico Nanodrop!!! |
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carmilla983
Nuovo Arrivato
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Inserito il - 04 luglio 2007 : 16:49:20
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dunque mi spiego meglio..ho trovato che nella mia provetta la concentrazione di DNA era pari 2,94 microgr su microlitro. nel protocollo c'era scritto che se fosse stato necessario si doveva diluire il campione in possesso per portarlo ad una concentrazione pari a 2 microgr su microl.
secondo voi dovevo farlo?perchè io non l'ho ritenuto necessario ma mi hanno fatto fare cmq i calcoli. assumendo un volume finale di 8 microlitri (max volume da caricare nel gel x l'elettroforesi) quanti microlitri del mio campione dovevo mettere se lo diluivo a 2 ug/ul.
aiuto!
 anch'io voglio nanodrop! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 luglio 2007 : 23:50:25
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Ah ecco prima c'era qualcosa che non mi tornava con le unità di misura era 2ug/ul non 2ug/ml... 
Allora per portarlo da 2.94ug/ul a 2ug/ul in 8ul dovevi prendere 5.44ul di DNA.
2ug/ul : 2.94ug/ul x 8ul = 5.44ul
però poi ti hanno detto quanto ne dovevi seminare?
se lo dovevi seminare tutto: 2ug/ul x 8ul = 16ug mi sembra un po' tantino da seminare su gel!!!
Dipende anche dal gel, ma in genere si semina attorno a 0.5-1ug di DNA genomico. |
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carmilla983
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Inserito il - 05 luglio 2007 : 10:23:28
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non ho capito cosa vuol dire "se lo dovevi seminare tutto"..il gel era allo 0,8 %... anche a me è venuto 5,44 ul, volevo una conferma!
io nn l'ho diluito a 2 ug/ul perchè non mi è sembrato necessario quindi ho usato la mia concentrazione (2,94 ug/ul) per determinare il volume di 10 ugr di DNA che mi chiedeva il protocollo ottenendo un volume pari a 3,40 ul. secondo te invece dovevo farlo?perchè unito il buffer è venuto un volume pari a 5,40 ul (l'elettroforesi poi è riuscita anche se il volume tot era poco)
grazie per le info! |
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GFPina
Moderatore
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8408 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2007 : 00:54:28
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Volevo semplicemente sapere che quantità (ug) ti avevano detto di caricare su gel!
A questo punto immagino che fosse 10ug! Il fatto è solo che mi sembrava una quantità eccessiva da caricare su gel... ma comunque va bene, l'importante è che tu abbia seguito il protocollo che ti hanno dato!
Secondo me comunque hai fatto bene non era necessario diluire, il volume che hai caricato non era poi così poco!!! E poi se l'elettroforesi è venuta bene...
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quantificazione mediante spettrofotometro
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