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dabar
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 Inserito il - 30 ottobre 2007 : 21:05:57
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Ciao ragazzi, qualcuno di voi fa Northern non radioattivo????
avete dei consigli di base...a partire per esempio dalle sonde da usare...e poi se mi date vostro cntatto (anche msn) per potere parlarne meglio e scamb delle opinioni.
Grazie a presto
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2007 : 00:41:41
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Sinceramente io non l'ho mai usato ma si può utilizzare la chemiluminescenza, ma la sensibilità e diminuisce soprattutto il background è maggiore.
Se cerchi tra le ditte le trovi le sonde
esempio al volo http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=C2FABBDE-F46E-471E-A907-3CB9802A393D
ho usato una cosa simile per un EMSA chemioluminescente... il risultato è apprezzabile, ma di certo non eguaglia il radioattivo.
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dabar
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Prov.: Catania
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30 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2007 : 10:38:43
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Grazie Neuroscience, gentilissimo...l'hai già provato?...
Il sistema sembra essere buono e peraltro il kit permette di ottenere sonde marcate direttamente con HRP e non marcate con DIG...sicchè si dovrebbe ottenere una sensibilità maggiore rispetto al metodo indiretto con DIG...no?...a tal proposito siccome ottenere una ribosonda mi viene un po' complicato...che esperienza hai con sonde a cDNA?
Aspetto una tua risposta.
Grazie ancora.
dabar |
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dabar
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Prov.: Catania
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30 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2007 : 10:41:20
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...dimenticavo...cosa è la EMSA chemioluminescente??? ...c'entra con il Northern?
A presto |
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sdspage
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6 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2007 : 10:56:58
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| puoi usare il sistema della biotina |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2007 : 12:24:46
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Entrambe le tecniche sono simili per la presenza di sonde radioattive, ma lo scopo e la procedura sono completamente diversi.
Io ho sempre fatto il Southern radioattivo, ma so dell'esistenza di tecniche alternative. Nel caso dell'EMSA (in genere anch'essa una tecnica che usa radioattivo) ho utilizzato un approccio alternativo chemioluminescente che ha dato buoni risultati.
E' da dire che nella mia esperienza la tecnica di elezione è quella radioattiva almeno per ora, poiché ha più sensibilità, specificità ed è più quantitativa rispetto alla chemioluminescenza, gli EMSA radioattivi che facevo erano di sicuro migliori di quelli chemioluminescenti che ho fatto ultimamente.
Spero che nel futuro le tecniche radioattive possano essere soppiantate da ottime tecniche alternative meno pericolose, ma di fatto non è ancora così.
P.S.: non so se ti interessa ma io per evitare di fare una serie di Southern ultimamente ho fatto una Long PCR (Expand della Roche) sul frammento di DNA genomico tagliato, poi ho sequenziato alcune zone dell'amplificato. In questo modo ho dimostrato la specificità senza usare il radioattivo...
non so se ti può essere utile questa info.
Citazione:
Messaggio inserito da dabar
...dimenticavo...cosa è la EMSA chemioluminescente???...c'entra con il Northern?
A presto
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dabar
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30 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2007 : 13:44:15
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Grazie neuroscience!!!
...allora il mio problema è andare a vedere se esistono ed eventualmente come si comportano su diversi tessuti delle isoforme trascrizionali di un gene.
...sto provando....dopo tante PCR normali (non Long) con varie cp di primers (con Fw disegnati a monte del gene e Rev disegnati a valle del gene) andate a male...(aspecifici,...ma del mio cDNA superiore alle 3,5 Kb neppure traccia), ad utilizzare un ultimo tentativo (una Long con LA Taq della Takara)...ma sicuramente la tecnica che meglio mi permetterà di discriminare è il Northern...è per questo che sto cercando di avere più info possibili circa la tecnica non radioattiva!
...Scusami ma ne approfitto per richiederti cosa è esattamente questa EMSA e per avere qualche dritta sulla tua Long PCR...quale protocollo (Denaturation, Annealing, Elongation...tempi, temperature e cicli) hai usato?
Grazie ancora.
Ciao.
dabar |
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NORTHERN BLOT non radioattivo!!!
Didattica
