| Autore |
Discussione |
|
|
dabar
Nuovo Arrivato
Prov.: Catania
Città: Catania
30 Messaggi |
 Inserito il - 11 novembre 2007 : 21:48:23
|
Ciao ragazzi,
ho un problema...è da un bel po' di tempo che cerco di amplificare attraverso PCR un gene per cui ho evidenze (tramite banche dati EST) che codifichi per 2 (o più) isoforme trascrizionali.In particolare, per avere il quadro completo della situazione ho deciso di disegnare diverse coppie di primers che cadessero agli estremi del (o dei) cDNA ottenuto(i) per retrotrascrizione di RNA totale (da diversi tessuti). In questo modo se vi fossero delle isoforme dovute a splicing alternativo (che cambi l'organizzazione dei trascritti maturi in regioni comprese tra i primers utilizzati), esse dovrebbero essere messe in evidenza...BENE...anzi MALE: non sono riuscito ad avere risultati...neppure la banda attesa dell'isoforma per cui si hanno evidenze sperimentali è stata messa in evidenza...questo trascritto è lungo circa 3Kb...premesso che ho provato con diverse cp di primers...(e nessuna ha dato risultati...) cosa può essere? che la retrotrascrizione non riesca a retrotrascrivere questi frammenti più lunghetti?? oppure che le condizioni di PCR che uso (condizioni classiche di PCR; Long-PCR...ho procvato anche una RT-PCR One step partendo dall'RNA)...avete qualche consiglio???-...magari condizioni di reazione particolari o che so io???
Aspetto ansioso...
Bye.
dabar
|
|
|
|
|
darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2007 : 23:05:09
|
credo che tu abbia già provato a variare parametri come Tm e concentrazione Mg++.
io proverei disegnando una coppia di primers che amplifichino una sequenza centrale dell'rna di circa 200-300 basi. se vedi l'amplificato, allora l'errore è da ricercare nel protocollo.
altrimenti... |
 |
|
|
dabar
Nuovo Arrivato
Prov.: Catania
Città: Catania
30 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2007 : 23:13:02
|
Ciao darkene,
grazie!...allora già questa prova l'ho fatta con una cp di primers disegnata nella parte 5' del trascritto per cui esiste già evidenza sperimentale. L'amplimero è di circa 400 bp e viene tranquillamente messo in evidenza...il problema è che in quella regione le due isoforme sono identche, quindi non riesco ad evidenziare differenze.
...quindi tu dici che c'è qualcosa di sbagliato nel protocollo...cosa secondo te?
a presto e grazie ancora.
dabar |
|
|
|
darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 12 novembre 2007 : 00:10:26
|
| allora il problema sta secondo me al 3' del gene. voglio dire, se il primer al 5' funziona perchè l'hai usato nell'amplimero piccolo, forse quello che tu credi essere il primer 3' non si annila. f'orse lrna (o gli rna) sono più corti? |
|
|
|
Balsamo del Canadà
Nuovo Arrivato
Prov.: Verbano-Cusio-Ossola
Città: Verbania
97 Messaggi |
Inserito il - 12 novembre 2007 : 09:34:20
|
| Premettendo che non ho mai lavorato sul cDNA... non potresti intanto fare un Northern Blot? Usi le sequenze EST per farti una sonda..o meglio ancora l'amplicon di 400bp comune alle due isoforme. Il northern è l'unico metodo che ti permette di visualizzare direttamente lo splicing alternativo...inoltre è una tecnoca preparativa, quindi puoi anche recuperare il frammento dal gel dopo... |
-B.del C.- |
|
|
|
dabar
Nuovo Arrivato
Prov.: Catania
Città: Catania
30 Messaggi |
Inserito il - 12 novembre 2007 : 19:40:22
|
Intanto grazie Balsamo del Canadà.
...ci avevo già pensato, tanto che una settimana fa avevo aperto una discussione circa il Northern Blot...allora ci sono 2 problemi:
1) Nel mio lab non usiamo questa tecnica ed anche quando la volessimo usare saremmo limitati dal non potere utilizzare il radioattivo...Pertanto sto cercando parecchie info per metodi alternativi. Da questo punto di vista mi sto focalizzando sul sistema AlkPhos della Amersham se non sbaglio, che sfrutta comunque la chemioluminescenza tramite il sistema biotina/streptavidina...ma il mio dubbio atroce è la ensibilità di questa tecnica: ho paura che magari in un tessuto dove una delle isoforme è espressa poco cio sia un risultato di falso negativo...a tal proposito mi sai dire qualcosa? Hai esperienza? ed in caso quale metodo di Northern non radioattivo usare (es: marcatura diretta od indiretta delle sonde?...massa di RNA totale di partenza da cui partire?...);
2)Nel frattempo che tutti questi miei dubbi spero si dissipino al più presto, vorrei tentare di continuare la messa a punto dei primers attraverso PCR...qualche dritta?
...Aspetto caldamente notizie.
a presto
dabar |
|
|
|
Balsamo del Canadà
Nuovo Arrivato
Prov.: Verbano-Cusio-Ossola
Città: Verbania
97 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2007 : 12:01:03
|
Citazione:
Messaggio inserito da dabar
Intanto grazie Balsamo del Canadà.
...ci avevo già pensato, tanto che una settimana fa avevo aperto una discussione circa il Northern Blot...allora ci sono 2 problemi:
1) Nel mio lab non usiamo questa tecnica ed anche quando la volessimo usare saremmo limitati dal non potere utilizzare il radioattivo...Pertanto sto cercando parecchie info per metodi alternativi. Da questo punto di vista mi sto focalizzando sul sistema AlkPhos della Amersham se non sbaglio, che sfrutta comunque la chemioluminescenza tramite il sistema biotina/streptavidina...ma il mio dubbio atroce è la ensibilità di questa tecnica: ho paura che magari in un tessuto dove una delle isoforme è espressa poco cio sia un risultato di falso negativo...a tal proposito mi sai dire qualcosa? Hai esperienza? ed in caso quale metodo di Northern non radioattivo usare (es: marcatura diretta od indiretta delle sonde?...massa di RNA totale di partenza da cui partire?...);
2)Nel frattempo che tutti questi miei dubbi spero si dissipino al più presto, vorrei tentare di continuare la messa a punto dei primers attraverso PCR...qualche dritta?
...Aspetto caldamente notizie.
a presto
dabar
Beh io ho lavorato nel mio tirocinio solo su DNA, che ovviamente crea molti meno problemi. Quindi posso solo dirti cose relative allo studio più che all'esperienza. Però magari possono essere utili...
Allora, il sistema AlkPhos presumo sottointenda la rivelazione con Fosfatasi Alcalina. Esiste anche un altro sistema coniugato alla biotina che è l'utilizzo della perossidasi, questo non usa la chemioluminescenza ma la formazione di precipitati blu insolubili. La rivelazione si basa sull'aggiunta, dopo il lavaggio degli eccessi, di altri due reagenti. So anche i nomi, se ti interessano te li scrivo. Il difetto principale è che la biotina si lega facilmente ai filtri di nylon del blotting..quindi più che altro può dare falsi positivi...questo però lo risolvi progettando bene la preibridazione e spingendo al massimo il capping del filtro. Non so, magari puoi aumentare le quantità di reagente di Denhardt o di DNA esogeno (solitamente DNA estratto da sperma di salmone)
Per la sensibilità posso dirti che è meglio non partire dall'RNA totale, ma conviene estrarre il solo mRNA, soprattutto se il trascritto di cui parli è poco rappresentativo. Se proprio vuoi essere sicuro di avere dei trascritti completi esistono dei protocolli per selezionare solo gli mRNA cappati o solo i cDNA completi (non so i nomi dei kit commerciali, ma si chiamano OligoCapping ed OligoCAPture).
Per la progettazione dei primer su cosa ti sei basato? Hai parlato di evidenze sperimentali, vuol dire che erano primer già usati da altri?
Comunque se il problema è nel 3' magari vuol dire che ci sono delle strutture secondarie nell'mRNA e non funziona bene la RT. Prova ad aumentare la temperatura di polimerizzazione...so dell'esistenza di una particolare trascrittasi, la Superscript, che oltre a non avere una attività di RnasiH funziona tipo a 50°C (così le strutture secondarie si denaturano) ed è molto processiva.
|
-B.del C.- |
|
|
|
BIOmartina
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 15:52:32
|
| Premettendo ke ank'io lavoro solo con DNA, secondo me il problema della mancATa amplificazione è legato alla lunghezza del prodotto atteso...3Kb sono circa 3000nt da amplificare....prova a migliorare il protocollo PCR aumentando la concentrazione di nt, magnesio e quindi anke TAQ! Forse anke usando una TAQ più costosa(quindi migliore) potresti avere buoni risultati! Non so potrebbero essere delle idee |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 17:11:42
|
Ciao Dabar,
Non so se il problema è nella retrotrascrizione, ma che protocollo usi?
Usi oligodT o random primers?
Comunque per evitare la formazione di strutture secondarie nell'RNA io faccio un primo step a 65°C per 5min. |
|
|
|
dabar
Nuovo Arrivato
Prov.: Catania
Città: Catania
30 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 18:24:26
|
Grazie BioMaritna e GFPina,
sono ottime idee.
Pe rquanto riguarda la fase di RT, io preima di fare la RT vera e propria (comunque sto usando un protocollo One step) faccio denaturare l'RNA a 70°C per 4'.
...Devo dire che usando una coppia di primers ibrida sto iniziando avere dei risultati "decenti" usando comunque un protocollo standard di RT PCR One step...sono riuscito ad amplificare con un certo successo l'isoforma Long di 2,1 Kb circa...ma ancora c'è da lavorare perchè con le stesse condizioni ho trovato una banda che sembra essre l'isoforma short (a circa 1,7 Kb) su un altro tessuto, ma la reazione è poco efficiente e vengono un poco di bande aspecifiche...provero' rendere più stringente la reazio9ne e magari ad isolare le bande di interesse e farci una nested...cosa ne pensate???
...in più qelle bande aspecifiche mi sanno di altre possibili isoforme trascrizionali...secondo voi puo' essere?
...fatemi avere vostre idee..
a presto e grazie ancora |
|
|
|
Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 19:17:20
|
Caro Dabar,
il tuo problema non è per nulla banale e coinvolge una serie di meccanismi ed accorgimenti che in genere sono in possesso solo di una persona che ha fatto queste cose un sacco di volte.
Ti elenco le problematiche possibili e possibilmente come risolverli
1) La causa più comune nella mia esperienza è che calcoli male la Tm degli oligo, spesso si usano formule antiquate come Tm=4*(G o C) + 2*(A o T) o formule simili per il calcolo, talvolta anche i programmi disegnati per fare ciò sbagliano di grosso, quindi non fermarti ad un solo calcolo ed una sola coppia di oligo, provane diverse coppie in diverse condizioni e regioni.
2) 3000 bp per le comuni Taq sono troppe, specie se è in concomitanza di un tratto di DNA non ideale e con primers non ideali, quindi dovresti usare la Taq Expand, la Clonthec, la Pfu, Taq High Fidelity che sono molto più robuste ed efficienti per lunghi tratti
3)Fai male l'estrazione di RNA in modo tale da degradarlo parzialmente, quindi il tuo gene di 3000 bp è stato diviso in 3 parti da circa 1000 bp ciascuno, quindi funziona la PCR su un tratto piccolo e non per tratti più lunghi, in questo caso potresti amplificare delle sottoregioni e poi riunirle, o fai un controllo su un gene privo di splicings di pari lunghezza
4) L'efficienza di retrotrascrizione potrebbe essere carente per la presenza di contaminanti vari o scarsa qualità/quantità dell'RNA di partenza. Prova una retrotrascrizione sia con oligodT che con esoesameri
4) La sequenza è troppo ricca in GC o forma strutture secondarie rompiscatole, dovresti verificarne la % di GC con l'aiuto di qualche programma, magari potresti usare un po' di DMSO da 0 a 5% nella PCR o formammide.
5) C'è una forma di splicing che non hai considerato per cui gli oligo che tu disegni si trovano a cavallo o dentro esoni non presenti o più distanti di quanto di aspetteresti
6) Fai una nested sulle bande dopo purificazione per essere sicuro che siano ciò che cerchi.
ovvio che il Northen sarebbe l'ideale nel tuo caso, o quantomeno il Southern sulla PCR.
 |
|
|
|
dabar
Nuovo Arrivato
Prov.: Catania
Città: Catania
30 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 19:25:36
|
Grazie Neuroscience.
Prenderò in considerazione tutte queste variabili...anche se comunque con la rt-pcr one step, usando condizioni standard ed una cioppia di primers ibrida, sto iniziando ad avere risposte abbastanza soddisfacenti, con amplimeri di 2,1 Kb o meno...grazie ancora!
Ciao
Dabar |
|
|
|
Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 19:28:57
|
Non so se ricordo bene, ma so che la RT-PCR one step è a bassa sensibilità, ovvero non individua geni poco espressi e l'efficienza di amplificazione è inferiore alla tecnica classica a 2 enzimi,
informati a tal riguardo
|
|
|
| |
Discussione |
|
PCR
Didattica
