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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
 Inserito il - 15 novembre 2007 : 13:35:56
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ciao a tutti,
sono mesi che provo a indurre una proteina fusa alla gst senza risultati...ho provato a indurre con concentrazione bassissimi di IPTG (o.o5mM) a temperatura ambiente O.N. ma nulla... qualcuno ha idea del motivo per quale non riesco a indurre?
grazie
monica
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
 Inserito il - 15 novembre 2007 : 21:22:58
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capita anche a me a volte, è inutile, quando non si esprime non si esprime, nemmeno cambiando ceppo cellulare, a volte non si esprimono perchè proteine troppo lontane evolutivamente dal sistema coli, a volte (la maggiorparte dei casi) per il differente codon usage dell'organismo della proteina che cerchi di esprimere da quello di E. Coli.
Se proprio ti è indispensabile ti conviene ordinare un oligo codificante per quella proteina col codon usage dell'organismo in cui si esprime. Alcune ditte te li disegnano grazie ad algoritmi capaci di discernere tra i vari possibili oligo "sinonimi", quelli che trascrivono mRNA con strutture secondarie minime. Tu gli dici la sigla della proteina e l'organismo in cui la vuoi esprimere e loro ti danno il tuo cDNA in vettore, ma tutto questo ha un prezzo abbastanza alto.
In alternativa puoi provare a cambiare sistema di espressione.
che proteina è? di quale bestia? |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 06:13:45
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| e soprattutto che vettore di espressione è? |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 10:03:17
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| pGEX4T.... |
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MaryngA
Nuovo Arrivato
Prov.: Parma
Città: Parma
29 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 10:03:23
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| Stai usando il sistema pET28? Io ho sempre indotto con una conc finale di IPTG 1 mM e quando avevo problemi di induzione ma soprattutto di solubilità facevo induzioni a temperature + basse e x tempi maggiori ad esempio 30°C per 6 ore o se ne hai la possibilità 4°C per diversi giorni anke una settimana! |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 10:04:48
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| il vettore è pGEX4T...io ho provato di tutto...quello di tenerlo a 4gradi per una settimana mi manca... |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 13:42:46
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cambia vettore
prova un mbp, his tag, etc etc etc
metti il tag al 3'
T.
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 14:18:12
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| ok grazie mille |
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 18:28:21
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| Io tutti i costrutti GST-tag in vettori pGEX-4T riuscivo ad indurli molto bene (in batteri BL21)...usavo 0,1mM IPTG per 6 ore a 30°C in movimento... |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 19:26:40
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| scusa la domanda banale..ma sposti l agitatore a 30 dopo che i batteri sono arrivati a o.6...o fai crescere il rinfresco anche a 30 gradi..cosa usi per purificare..ma il movimento credi sia fondamentale...noi abbiamo una camera a 37 e non posso spostare la temp...quindi di solito li lascio sul bancone |
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 22:25:20
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se li lasci sul bancone difficilmente cresceranno...  |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 13:21:17
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| cioè mi stai dicendo che probabilemente non crescono perkè non stanno in agitazione? |
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 15:12:34
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| sinceramente non riesco a capire come possano crescere se non stanno in agitazione... un problema potrebbe essere questo... da quello che ho capito nei tuoi messeggi hai uno shaker in una stanza, quindi non chiuso? strano... comuque quando si esprimono proteine di fusione la temperatura la si abbassa anche a 25 gradi... prenotati uno shaker chiuso in cui puoi abbassare la temperatura... ciao |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 15:28:49
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| LA STANZA è PICCOLA E HA LA TEMPERATURA CONTROLLATA DA UN TERMOSTATO ..CMQ è SIGILLATA ERMETICAMENTE |
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MaryngA
Nuovo Arrivato
Prov.: Parma
Città: Parma
29 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 16:02:26
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| Devono stare assolutamente in agitazione se no crescono pochissimo o niente... non arriva aria e il terreno ristagna! |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 16:11:21
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| POSSO CHIUEDERE LA BEUTA CN IL PARAFILM.. |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 17:56:00
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ma che risposta é?
e cmq per favore evita di usare il maiuscolo.
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 10:26:11
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| ho davvero difficoltà a credere (non per colpa di mo-lab) che in un'università italiana non esistano degli shaker termostatati... mah! |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 13:43:39
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| ti spiego...gli agitatori chiusi e temostatati esistono nella nostra universita...purtroppo non esistono nel piano in cui sto...abbiamo solo una stanza termostata (con 2 agitatori) molto piccola che è comune quindi se io sposto la temperatura potrei pure rischiare di essere linciata...cmq ho gia trovato il modo di risolvere il mio problema.. |
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manumanui
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2008 : 18:26:48
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ciao a tutti! è la prima volta che uso questo forum..ho un problema con le proteine di fusione con la gst..purtroppo fino a che ho provato a produrre singoli domini proteici non ho avuto problemi, ora ho clonato dei frammenti più grandi codificanti per parti più grandi di una proteina (e anche per la proteina intera) e sigh si verifica una notevole degradazione...prevalgono, dopo attacco alla resina, frammenti parziali...io ho sempre fatto crescita a 37°C in agitazione fino a OD 0,5, induzione con IPTG 1mM da1h a 4 h...ho provato appunto a diminuire i tempi per vedere se evitavo la degradazione..come cellule ho solo le bl21, che, ripeto, son senpre state ottime per i singoli domini...
potete aiutarmi?
un'ultima cosa..in un lavoro di giapponesi riuscivano a produrre i diversi mutanti, o cmq molto simili...ma non ho proprio tutto questo coraggio per chiedere aiuto a loro :) |
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magdziec
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 28 agosto 2009 : 12:52:21
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| Ciao a tutti, spero che qualcuno di voi sappia darmi un consiglio su come risolvere il mio problema. Voglio clonare 2 proteine nello stesso vettore senza usare alcun sistema di purificazione tipo GSP. Ho inserito il secondo gene nel MCS che onteneva gia'il gene della prima proteina, lasciando una sequenza con RBS in mezzo. Il primo gene finiva con lo stop codon per ottere subito le proteine separate naturalemnte dotate della sequenza segnale per il trasferimento al periplasma. Dal sequenziamento del prodotto PCR risulta che entrambi i geni sono presenti e inseriti nella direzione giusta, le colonie sono state trasformate con successo ma non si esprime la proteina. Si tratta di 2 eme-proteine che dovrebbero dare la colorazione rossa al pellet; il mio e' sempre bianco nonostante che abbia usato il ceppo trasformato con pEC86. Qualcuno sa dove ho sbagliato? |
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Discussione |
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induzione proteina di fusione in BL21
Didattica
