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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 15 dicembre 2007 : 13:32:52
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secondo la vostra esperienza, posso conservare un campione di RNA a
-20°C per 2 (max 3) giorni, senza correre il rischio che si rovini?
e un'altra cosa: come si procede per staccare le cellule adese in piastra per ottenere il pellet da cui fare l'estrazione? solo con tripsina?
grazie 
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2007 : 13:44:26
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Beh 2-3 giorni non succede proprio niente, io lo tengo sempre a -20 anzi -30°C perché sta più sicuro che nel -80°C!!! 
Per l'estrazione dipende dal metodo che usi, puoi o tripsinizzare e poi estrarre dal pellet oppure utilizzare una soluzione di lisi che lisa direttamente le cellule nella piastra. Io uso una soluzione di lisi di un kit commerciale che contiene Tiocianato di Guanidinio e schifezze varie appena la metti a contatto con le cellule si "disintegrano"!!! (mi fa sempre impressione vedere l'effetto!) |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2007 : 14:27:35
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grazie GFPina
per l'estrazione, mi avevano consigliato di usare la tripsina, e poi usare il trizol su pellet.
il problema è nato durante la procedura perchè le mie cellule sono terminalmente differenziate e hanno 21 giorni dalla confluenza...non riuscirò mai a staccare queste cellule con la tripsina!!! 
quindi, presa un po' dai turchi e dato che si erano fatte le 19 e non c'era nessuno ad aiutarmi, ho fatto una cosa un po' azzardata e cioè, ho raccolto le cellule screpandole! forse ho fatto una sciocchezza, ma ho cercato di essere delicata e dato che le mie sono cellule epiteliali, ho fatto in modo da staccare interi pezzetti di epitelio. alla fine l'RNA è venuto fuori.
...mah, speriamo bene 
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2007 : 16:28:26
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Ma scusa Iside se usi il Trizol perché non lisi direttamente le cellule con quello nella piastra?
Comunque anche se metti la tripsina puoi screpparle un po'! Tanto non ti interessa che le cellule siano intere per l'estrazione dell'RNA devi comunque romperle! La cosa migliore comunque è tenere le piastre su ghiaccio o su una piastra fredda mentre le lisi così eviti che si danneggi l'RNA!
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2007 : 18:42:20
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Ma scusa Iside se usi il Trizol perché non lisi direttamente le cellule con quello nella piastra?
non ho mai lavorato con RNA purtroppo. ho usato il Trizol e comunque la volta prossima volta seguo il tuo consiglio di lisare direttamente in piastra. non so cosa aspettarmi da questa estrazione perchè ho commesso una serie di imprecisioni  .
ad ogni modo, grazie dei consigli |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2007 : 22:09:27
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Ma non hai il protocollo de Trizol?
Se no lo trovi qui
Comunque magari e venuto comunque, incrocio le dita!
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Michy981
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2007 : 22:26:39
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Comunque si può usare lo screaper anche senza soluzione di lisi: puoi mettere in piastra del normalissimo PBS ed utilizzare lo screaper, una volta "staccate le cellule puoi raccogliere e pellettare; quando hai il pellet butti il PBS ed inserisci la soluzione di lisi nella Falcon dove hai pellettato. Hai diverse alternative alla tripsina, ma soprattutto dipende da cosa devi estrarre, se tu cercassi proteine transmembrana non potresti usare la tripsina per esempio.
Per quanto riguarda il mantenimento dell'RNA puoi mantenerlo alcuni giorni a meno 20 gradi, però è sempre meglio, quando possibile, lavorare sul fresco.
Ciao |
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RNA a -20°C
Didattica
