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luke86
Nuovo Arrivato
Prov.: Ravenna
Città: riolo terme
10 Messaggi |
 Inserito il - 02 gennaio 2008 : 15:01:28
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Ciao ragazzi..mi sono iscritto da poco e non so neanche e sia la sezione giusta del forum...tra poco devo dare l'esame di genetica molecolare e sono andato in panico su un paio di cose...se qualcuno mi aiuta lo ringrazierò a vita...
1) Il Dna minisatellite e microsatellite,la loro posizione e funzione nei cromosomi, RFLP,VNTR e STR e individuazione dei polimorfismi genetici attraverso l'uso di sonde d'ibridazione..
2)Il sitema di ricombinazione sito specifica Cre-Lox e KO...
Grazie...e se queste cose sono gia state spiegate nel forum scusate ma nn lo sapevo...
Ciao a tutti...
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luke.... |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 02 gennaio 2008 : 15:33:02
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questi sono argomenti un po' lunghi da trattare in un forum. posso darti qualche breve info, se poi hai domande specifiche è meglio:
- I minisatelliti (VNTR, Variable Number of Tandem Repeats): sequenze > 6 bp che variano da individuo a individuo per il numero di ripetizioni in tandem; frequenza omogenea nel genoma ogni 100 Kb; rilevabili per PCR o sonde di ibridazione in situ (Southern Blot).
- I microsatelliti (STR, Short Tandem Repeats): come i minisatelliti ma composti da sequenze di 2-5 bp.
- RFLP (restriction fragment length polymorphism): mutazione che distrugge o crea un sito di restrizione, e genera quindi un frammento di lunghezza diversa dal wt. rilevabile per PCR o Southern Blot.
-Il sistema cre-lox sfrutta delle particolari sequenze del DNA del batteriofago P1 chiamate "loxP", sequenze che il virus normalmente usa come segnale di excisione x il suo DNA da quello dell'ospite. Cre è una ricombinasi, un enzima che riconosce le sequenze loxP, taglia il DNA in questi siti e lo circolarizza.
Supponi di voler studiare cosa succede eliminando una certa proteina ad es nel fegato. Potresti fare un topo KO, ma se la delezione completa di questa proteina in tutti i tessuti non è vitale questo non è possibile.
Puoi in questo caso creare un topo transgenico che abbia il tuo gene di interesse affiancato da sequenze loxP (tipo ---loxP-[GENE]-loxP---) e lo accoppi con un altro topo transgenico che ad es. esprima Cre sotto il controllo di un promotore specifico x il fegato (o x il tessuto che vuoi tu): la progenie (o meglio, parte della progenie) esprimerà Cre nel tessuto di interesse e quindi in quel tessuto il gene sarà exciso (perchè ha le sequenze loxP attorno). Negli altri tessuti le loxP ci sono, ma non c'è Cre, quindi il gene funziona normalmente. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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luke86
Nuovo Arrivato
Prov.: Ravenna
Città: riolo terme
10 Messaggi |
Inserito il - 02 gennaio 2008 : 17:58:31
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grazie siete stati anche troppo buoni....se mi vengono in mente domande piu specifiche prima dell'esame mi faccio vivo 
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luke.... |
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piwi
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2009 : 11:19:38
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salve a tutti voi del forum, mi sono appena iscrtto e avrei una cosa da chiedere.
Nn riesco a capire in che modo posso avere i topi knock-out condizionali. Per quel poco che ho capito si usano i siti lox e la ricombinasi cre ma nn tutto mi è chiaro.
correggetemi se sbaglio:
1: devo avere un topo che ha il mio gene con le sequenze lox e sull'altro cromosoma lo stesso gene che ha inserito il frammento per la resistenza alla neomicina
2: devo avere un altro topolino che possiede la ricombinasi cre sotto il controllo specifico di un promotore
3: li incrocio
il punto è: il topo cre ha solo la ricombinasi o ha anche il knock-out per il mio gene?
cosa ottengo dall'incrocio? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2009 : 12:25:34
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Credo sia spiegato qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=422
Ad ogni modo, diciamo che vuoi fare un topo KO per il gene A solo in un certo tipo cellulare che hai modo di selezionare perchè è il solo tipo cellulare del corpo che esprime il gene B.
Genererai un topo con il gene A fiancheggiato da siti loxP, quindi
------loxP---A---loxP----
Questo topo avrà il gene A fiancheggiato da loxP in TUTTE le cellule del corpo. Innanzitutto devi controllare che questo topo non sia differente dal wt, cioè che l'aggiunta di loxP non interferisca già di suo con l'espressione e la funzione di A.
Fatto questo, crei un altro topo che invece esprime Cre sotto il controllo del promotore di B
----PromB---Cre--------
Questo topo avrà il gene per cre in TUTTE le cellule del corpo, ma -almeno in teoria- lo esprimerà SOLO nel tuo tipo cellulare (che avrà gli opportuni fattori di trascrizione per trascrivere qualcosa sotto il controllo del promotore per B.
Quando dico almeno in teoria, intendo dire che potresti avere anche trascrizione in altri tipi cellulari, quindi anche qui bisogna fare una serie di controlli.
1) controllare che Cre sia espresso solo nelle tue cellule di interesse.
2) controllare che l'espressione di Cre non dia alcun fenotipo al topo.
A questo punto li incroci.
Siccome i siti loxP saranno tagliati in presenza di Cre e solo le tue cellule di interesse avranno Cre allora SOLO nelle tue cellule di interesse A sarà eliminato e quindi avrai il tuo KO selettivo.
Una nota importantissima: una volta che Cre ha fatto il suo lavoro (tagliare il DNA) il gene A non c'è più e non c'è più modo che si riformi. Questa è una cosa molto importante da tenere a mente perchè se per esempio il promotore di B viene attivato anche per un limitato periodo di tempo (es. nell'embriogenesi) in un altro tipo cellulare, otterrai un KO del tuo gene anche nell'altro tipo cellulare, anche se al momento in cui vai a guardare quel tipo cellulare NON esprime Cre. Insomma, una qualsiasi cellula che abbia espresso *in un qualsiasi momento della sua vita* Cre sarà KO. |
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piwi
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2009 : 15:17:49
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grazie mille chick80. ora la cosa sembra avere un pò più senso. |
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Discussione |
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microsatelliti, cre-lox e KO
