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fediscola
Nuovo Arrivato
Cittā: bristol
10 Messaggi |
 Inserito il - 14 gennaio 2008 : 01:19:56
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Salve a tutti,
ho un quesito da porre riguardo la defosforilazione della mia proteina target.
Ho eseguito un Western blot su una preparazione di cellule lisate HEK293 utilizzando un anticorpo anti-rabbit policlonale per il mi target (connessina 43).Dai risultati riesco a vedere una chiara banda appunto a 43kd, ma anche altre 2 bande al di sopra che potrbbereo rappresentare le forme fosforilate della mia connessina.(so di per certo dell'esistenza).Mi hanno suggerito di usare stesso sulla memmbrana del western la fosfatasi alcalina e verificare se le mie bande persistono o meno.Tuttavia io nn hon mai eseguito qsto trattamento e nn saprei nemmeno dove cercare un protocollo...
qualcuno puo' correre in mio soccorso?
grazie!
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fede |
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chick80
Moderatore
Cittā: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 03:47:35
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Mi suona strano che tu possa usare la fosfatasi sulla stessa membrana...
Io prenderei ogni campione e lo dividerei in 2 aliquote, una che tratti con la fosfatasi alcalina e l'altra no. Poi li carichi su gel e vedi se in quello trattato le bande sono scomparse. In questo modo hai anche un controllo interno.
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lā
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 18:38:19
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| io di solito,dopo aver sviluppato con la perossidasi, lavo la membrana per circa 10 min con TBS, poi ancora altri 10 min,semprecon TBS e poi 10 min con TBS tween Dopodichč incubo la membrana con l'anticorpo secondario coniugato con la fosfatasi alcalina. |
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Iside
Utente Attivo
Cittā: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 18:53:34
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| puoi usare anche un anticorpo contro i residui fosforilati, dipende da dove viene fosforilata la connessina, credo in tyr. anche se, credo che essendo un lisato totale avresti parecchie bande, ma conoscendo il peso molecolare potresti avere un riscontro. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Didattica
