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demish
Nuovo Arrivato
45 Messaggi |
 Inserito il - 15 gennaio 2008 : 19:24:57
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Ciao a tutti,
come potete vedere dall'immagine, in fondo mostra un southern blot e poi una pcr.
Forse la mia domanda è stupidissima ma ora mi sfugge:
perchè nel southern c'è anche l'allele normale invece nella pcr no?
Infatti se vedete l'immagine nel southern ci sono 3 linee e con la pcr solo la linea dell'allele mutato.
Ciao.
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MdM |
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demish
Nuovo Arrivato
45 Messaggi |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 22:13:46
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Corretto il link (ImageShack non mette le virgolette nel tag url)
Non è che le linee in alto nel Southern sono semplicemente i pozzetti?
Comunque dipende tutto da che sonde usi! :) |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 22:51:55
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tecnicamente ci dovrebbe essere anche la seconda banda di PCR per il tessuto normale,
però evidentemente la delezione interessa una regione genomica molto grande, altrimenti non avrebbe senso fare il southern blot.
Per cui se ammettiamo che si tratti di un frammento di circa 15.000 basi di DNA genomico in una cellula normale e che in seguito ad una delezione di un tratto si riduce a 1.000 basi (cellula tumorale).
Ovviamente per 15.000 basi è difficile fare una PCR, quindi il Southern è la soluzione più semplice.
Nel Southern si possono vedere entrambe le bande, poiché non c'è effetto competitivo tra la produzione della banda più piccola e della banda più grande.
Nella PCR, invece, le bande non possono avere grosse differenze di pesi molecolari in quanto la banda più piccola sarebbe l'unica prodotta poiché più facile e veloce da produrre, quindi non si avrebbe mai un eterozigote con una banda di 1000 basi ed una banda a 15.000 basi.
Probabilmente nella figura che è mostrata, la PCR non si può fare quando le cellule sono normali perché sarebbe troppo grande il frammento da amplificare, mentre nelle cellule mutanti la lunghezza rientra nel massimo range della PCR classica.
D'altra parte è da dire che attualmente con le metodiche disponibili è possibile fare delle PCR fino a 20.000 basi e qualche ditta promette anche di più, però i costi e l'ottimizzazione del protocollo renderebbe sempre più facile, veloce e sensibile il Southern.
E' da dire che attualmente sono disponibili anche dei kit che con diversi primers possono evidenziare le possibili delezioni, mutazioni o cambiamenti del DNA genomico, il tutto senza amplificare regioni di DNA molto lunghi. Il tutto con un'ottima sensibilità.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2008 : 01:59:31
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| Beh, ma comunque secondo me dipende da che sonda usi in Southern. Se la delezione è molto grossa potresti non vedere nulla nel tessuto normale no? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2008 : 02:13:32
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Si ma fornire del materiale agli studenti con delle figure provviste anche di discalia e magari di una qualità più decente no??? 
Se no qua le ipotesi si sprecano!!!  |
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demish
Nuovo Arrivato
45 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2008 : 09:24:17
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| beh più che all'efficienza della pcr, io avevo pensato al fatto che forse solo con la delezione si viene a creare il sito complementare al primer della pcr. |
MdM |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2008 : 14:50:25
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| Beh dalla figura sembrerebbe che i primers si attacchino anche alla sequenza wild type, ma ripeto... la qualità è veramente brutta! |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2008 : 01:56:33
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Beh, ma comunque secondo me dipende da che sonda usi in Southern. Se la delezione è molto grossa potresti non vedere nulla nel tessuto normale no?
Tecnicamente il Southern si dovrebbe fare proprio per vedere la delezione, sarebbe un po' strano generare una sonda tanto specifica che potrebbe vedere solo il frammento del DNA con quella specifica delezione. Di conseguenza la sonda riconoscerebbe anche frammenti di DNA più grandi.
Però credo che stiamo facendo tanto fumo per un disegnino che a mala pena dovrebbe dare una vaga idea della tecnica generale.
Il dettaglio del pozzetto/banda o errore che sia non è fondamentale per capire il concetto, quindi fate vobis...
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Discussione |
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Pcr e southern blot
Didattica
