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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
 Inserito il - 23 gennaio 2008 : 19:18:55
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ciao ragazzi...sto studiando i metodi di transfezione...
noto che alcuni, come il metodo della lipofectamina dice che son essenzialmente utilizzabili per transfezioni transienti...
ma cosa servono le transfezioni transienti???
ho sempre studiato fossero necessarie colture stabili con dna esogeno integrato con genoma ospite...per questo ci son i metodi di selezione con tetraciclina beta gal ecc...
cosa serve aver una cellula che contine dna esogeno per 48-72 ore senza integrarlo nel proprio???cosa si può studiare da questo???
non si può nemmeno creare una coltura cellulare...tanto morirebbero in 48 ore...nn hai il tempo di vedere se producono qualcosa...o no???
scusate ma son zero in genetica...grazie
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 21:22:15
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Se cerchi sul forum (usa il motore di ricerca interno) troverai
almeno 4 o 5 discussioni in cui se ne era già parlato.
Comunque sia:
Transienti --> espressione limitata nel tempo (pochi giorni)
Stabili --> espressione virtualmente illimitata
Fare una transfezione stabile è un processo lunghissimo e per
nulla facile (ci vuole una fase di selezione e isolamento clonale)
e serve solo se vuoi avere una popolazione cellulare altamente
esprimente e omogenea nell'espressione: serve per studi in cui
il prodotto genico dev'essere caratterizzato molto nel dettaglio
(oppure in cui ti servono cellule monoclonali, ad es. ibridomi).
Le transienti invece sono molto più semplici e diffuse: entro 72 ore
puoi benissimo osservare il tuo prodotto genico e fare tutti i saggi
che ti servono. Ovviamente devi raccogliere in tempi brevi le cellule
e screenarle, perchè se le lasci in coltura perdono l'espressione.
Se il tuo vettore d'espressione ha dato i risultati attesi, allora
puoi pensare di mettere su una transfezione stabile, altrimenti chi
te lo fa fare di faticare per 2 mesi x ottenere degli stabili inadatti?
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 21:22:16
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Per fare della trasfezioni stabili è necessario che il gene di tuo interesse sia clonato in un costrutto che si integri nel DNA della cellula (un costrutto virale, lentivirale, adenovirale)...se non si possiede il gene clonato in questi vettori, ma solo in un costrutto di espressione eucariotica, allora devi fare una trasfezione transiente. Inoltre, la trasfezione transiente risulta essere più efficace della trasfezione stabile (in quanto la quantità di DNA esogeno la decidi tu) e non dipende dall'infezione delle cellule e dal grado/capacità di integrazione del DNA nel genoma cellulare...
Se il tuo scopo è quello di ottenere proteine, la trasfezione transiente permette di ottenerne in grandi quantità (sempre a seconda del tipo cellulare e del tipo di costrutto trasfettato) dopo sole 36 ore dalla trasfezione... |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 21:25:39
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ho capito.quindi in pratica se faccio una transiente e lavoro molto in velocità mi posson dare dei risultati anche così?ad esempio proteine ricombinanti mi dite che son esprimibili anche in modo transiente.grazie capito.
inoltre anche come prova.grazie.
stabili ad esempio solo per cose complicate e lunghe come che so ad esempio un topo clonato? |
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 21:30:45
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| Non è una regola fissa...puoi benissimo decidere se trasfettare le linee cellulari in transiente oppure stabilmente, dipende dall'uso che devi farci con queste cellule e se possiedi i costrutti corretti... |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 21:30:58
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C'è un po' di confusione nel tuo intervento Luca-DNA,
se non ti offendi mi permetto di correggerti:
-Fare transienti o stabili NON dipende dal tipo di costrutto
che hai (virale o non virale) ma solo dal tuo fine. Nulla mi
impedisce di fare transienti con vettori virali e stabili con
vettori non virali, come i vettori plasmidici. Non è questo il punto.
-Il termine "costrutto di espressione eucariotica"
non è contrapposto a vettore virale: sia i vettori virali
(purchè non fagici) che i vettori plasmidici possono
essere definiti "costrutti di espressione eucariotica".
Costrutto è qualcosa di prodotto per ingegneria genetica,
sia esso un rDNA virale o un rDNA plasmidico.
- Non è assolutamente detto che la transiente porti, necessariamente,
ad una maggiore espressione nè tantomeno una maggiore "efficacia"
rispetto a quella stabile. Dipende infatti
a) dal tipo cellulare (alcuni tipi cellulari tendono aesprimere
poco o nulla in transiente, ma sono delle bombe in stabile)
b) dal tipo di metodo di transfezione
(unica variabile che determina l'"efficacia" della transfezione)
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 21:37:04
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| GRAZIE |
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 21:51:43
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Dionysos, accetto le tue precisazioni e correzioni...nel caso delle trasfezioni stabili ho generalizzato con uso di vettori virali perchè ho sempre utilizzato vettori lentivirali per fare linee cellulari stabili (mea culpa!!).
Sono daccordo con te sul fatto che il grado di trasfezione varia da cellula a cellula e che l'efficacia di trasfezione dipenda dal metodo utilizzato...ma includerei anche il tipo di costrutto trasfettato!!! |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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Drop83
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2008 : 15:54:25
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Salve a tutti!
Avrei un piccolo dubbio che mi assilla: sto utilizzando in lab un lentiviral-based vector pLKO1-puro per il silenziamento di una proteina. Lo sto utilizzando però come plasmide senza la funzionalità virale, quindi l'ho trasfettato direttamente nelle cellule e poi ho iniziato la selezione. E' possibile che dopo 30 giorni questo vettore venga ancora espresso e sia passato da una cellula all'altra??? Lo chiedo perchè, parallelamente al silenziamento, ho trasfettato le cellule con lo stesso vettore contenente la sequenza per esprimere GFP.....e ormai da + di 3 settimane queste cellule continuano ad esprimerla. Nel vettore non mi sembra però che ci siano gli elementi necessari per la sua replicazione..........Che spiegazione dareste???
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2008 : 20:10:14
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Citazione:
'ho trasfettato direttamente nelle cellule e poi ho iniziato la selezione. E' possibile che dopo 30 giorni questo vettore venga ancora espresso e sia passato da una cellula all'altra???
Sei hai fatto una 'selezione' (come hai scritto tu) è naturale ed ovvio
che le cellule persistano nell'esprimere il contenuto del vettore che
contiene il marcatore di selezione!
Questo perchè effettuando selezione vai a eliminare selettivamente
tutte le cellule incapaci di portare con se il marcatore nel corso
delle loro replicazioni: non occorre che il vettore si autoreplichi
(anche se a volte aiuta, caso dei vettori con Ori virali tipo SV40
o EBV) in quanto le cellule integrano nel loro genoma il vettore
tramite ricombinazione casuale, così lo replicano passivamente
assieme a tutto il genome durante la mitosi! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2008 : 20:12:01
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P.S. curiosità... il vettore virale esprime per caso shRNA
diretti contro la GFP? Lo fai per testare il vettore?
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Drop83
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2008 : 20:57:45
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Grazie Dionysos per la risposta!
Riguardo quello che hai chiesto: io sto utilizzando dei vettori virali contenenti le sequenze shRNA rivolte contro una proteina di mio interesse che sto studiando. Il costrutto con la GFP (uguale all'altro però al posto dell'shRNA c'è la GFP) lo utilizzavo solo come controllo positivo per vedere come si comportava tale vettore una volta trasfettato. Sia i silenzianti che quelli contenenti GFP li ho sottoposti a stessa selezione.
Effettivamente, visto che la GFP viene espressa ormai da 3 settimane abbondanti e che, comunque, le cellule che presentano fluorescenza continuano a crescere, credo anche io che l'integrazione sia l'unica possibilità....altrimenti non saprei cos'altro possa essere successo.
Comunque grazie ancora |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2008 : 23:01:29
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Ok.
Comunque così facendo hai verificato solo il comportamento
del vettore dal punto di vista della transfezione: so che
di solito è usanza verificare ANCHE la funzionalità silenziante
utilizzando almeno un shRNA diretto contro la stessa GFP
(contemporaneamente transfettata) per verificarne
l'abbattimento, in qualità di gene reporter.
Per questo te l'ho domandato!
...vabè... è che è un problema che sto attualmente vivendo io!
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TRANSFEZIONE TRANSIENTE VS STABILE???
Didattica
