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biotecman
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40 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2008 : 20:51:27

volevo una piccola delucidazione sull'analisi per PCR in seguito al DNA ottenuto per immunoprecipitazione della cromatina.

Ad esempio una volta immunoprecipitato p53 (legata ai suoi siti sul DNA) con l'anticorpo anti-p53 raccolgo e distacco gli immunoprecipitati dal DNA e conduco l'analisi di PCR.

Se uso primer che amplificano le regioni del gene di p21 e mdm2 dovrei attendermi delle bande (perch� quelle sequenze di DNA saranno precipitate con p53) se invece uso primers per es. IL-10, che � molto distante dai siti di legame di p53 non dovrei visualizzare alcuna banda.

Ma come vengono effettuati ulteriori controlli, vi sono controlli negativi? per essere pi� chiaro allego un'immagine del gel presente sulle slide che ho studiato: ho bisogno di spiegazioni sulla colonna di sx (quella senza bande) qualcuno pu� capire che amplificazione � stata condotta?

Immagine:

13,97 KB

aitan3
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Prov.: Napoli

71 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2008 : 21:06:05

credo che puo esser un sempice controllo della PCR; ovvero un controllo che ti esclude contaminazioni di DNA nelle soluzioni utilizzate nella PCR.
che ne dite?

biotecman
Nuovo Arrivato

40 Messaggi

Inserito il - 26 gennaio 2008 : 09:49:31

su degli appunti di una mia collega stava scritto qualcosa riguardo al controllo di un campione non immunoprecipitato. Ma non ho capito in che senso: se � un campione di DNA estratto normalmente, dovrebbe avvenire l'amplificazione, forse si tratta di un campione dove si � fatto precipitare il DNA assieme alle proteine che lo legano...

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 26 gennaio 2008 : 23:01:50

In genere quando fai l'IP (io ho fatto solo IP non ChIP) fai anche un controllo negativo, puoi farlo con un anticorpo non specifico oppure senza anticorpo, ti serve ad es. per vedere se c'� del legame aspecifico con le beads che usi per l'IP.
Probabilmente in questo caso intendono un controllo in cui non hai messo l'anticorpo. Il DNA non c'� perch� quello che non si lega viene lavato via!