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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
 Inserito il - 23 marzo 2008 : 11:17:18
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Scusate secondo voi per estrarre un gene che conosco da un genoma come posso fare?Potete vedere se il mio ragionamento fila :
1) frazionamento e purificazione di un estratto nucleare
2)trattamento con etanolo per precipitare gli acidi nucleici
3)PCR con ologonucleotidi di quel gene
poi ?????? grazie in anticipo
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Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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spika87
Nuovo Arrivato
Città: roma
60 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2008 : 18:59:49
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Beh se conosco il gene io proverei con gli enzimi di restrizione,uso lo stesso(p.es Eco1)sia per il mio gene sia per il vettore scelto(come un plasmide)ottenendo così un plasmide ricombinante che porta l'informazione del mio gene oppure tutt'altro metodo:conosco il gene giusto?quindi conosco la sua sequenza nucleotidica(per via delle banche genomiche) e mediante southern posso frammentare il mio genoma in vari frammenti e a quel punto mediante una sonda complementare alla sequenza nota isolo il gene....mi vengono in mente queste idee...fammi sapere che ne pensi! |
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2008 : 19:24:18
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ciao! se ho capito bene tu conosci il gene e la sua collocazione nel genoma... allora io farei cosi: 1)cercherei in quale cellule è espresso, 2) trovo la linea cellulare che lo esprime e sono fortunato che la posseggo (che ne so i linfociti T...) ed estraggo RNA e preparo cDNA;3)cerco in banca dati il messagero (in NCBI lo trovi), individuato il cDNA disegnerei dei primer e amplificherei i pezzetti per pcr (dipende quanto è lungo); 4)mediante ligazione lo inserisci nel vettore di interesse 5)transformi in batteri cosi te ne produci un bel pò... e procedi con tuoi esperimenti.. ciao  [:) |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2008 : 20:25:04
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bepo...sei proprio fuori pista
spika87 quello che dici tu lo facevano prima che mullis scoprisse la PCR(per la prima ) ,per la seconda sei anche tu fuori pista
l unica soluzione PCR su DNA genomico
se lo devi clonare in un vettore,aggiungi al primer in 5' dei siti di restrizione desiderati
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imy85x
Nuovo Arrivato
Città: napoli
110 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2008 : 20:57:53
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Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
bepo...sei proprio fuori pista
spika87 quello che dici tu lo facevano prima che mullis scoprisse la PCR(per la prima ) ,per la seconda sei anche tu fuori pista
l unica soluzione PCR su DNA genomico
se lo devi clonare in un vettore,aggiungi al primer in 5' dei siti di restrizione desiderati
ahahahaha sempre il solito spietato |
Imy
Le persone che meritano fiducia sono quelle che ti stanno accanto anche quando non le ami abbastanza.
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2008 : 22:37:33
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| ok patrizio, non saprei si fa a clonare un intero gene considerando introni. ciau! |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2008 : 16:51:44
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Citazione:
Messaggio inserito da bepo
ok patrizio, non saprei si fa a clonare un intero gene considerando introni. ciau!
Diciamo che dipende da cosa ne vorresti fare del tuo gene..che tipo di studio condurre..se ti serve la proteina etc...
cmq..se il tuo gene e' di 2Mb .. a questo punto ordini un BAC e stai apposto |
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spika87
Nuovo Arrivato
Città: roma
60 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2008 : 19:08:28
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| in realtà non capisco come con la tecnica di southern io possa essere fuori strada...la richiesta iniziale era quella di estrarre un gene (che già conosco)dal genoma di partenza,quindi io la sequenza del gene la conosco giusto?Devo solo estrarlo...Con la tecnica southern ai frammenti diversi fissati su membrana filtrante aggiungo una sonda marcata (che costruisco in base alla sequenza del gene) che ibriderà al mio frammento complementare...no??? |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2008 : 19:16:06
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MA VOI TUTTI AVETE RAGIONE.....ANCHE SE VI DICO CON CERTEZZA CHE USARE UN CLONAGGIO è TROPPO LUNGO NEL CASO, DICO, SI CONOSCA LA SEQUENZA DEL GENE , USARE UNA PCR è L'IDEALE...IL MIO PROBLEMA PERO NN è STATO RISOLTO...PERCHE VI HO CHIESTO COME FARE AD ESTRARRE UN GENE SE NN SAI LA SUA SEQUENZA SAI SOLO DICIAMO LA SUA FUNZIONE..NN MI RISPONDETE SOLO USARE UN CLOBNAGGIO FUNZIONALE CHE Là CI ARRIVANO TUTTI , VORREI CHE QUALCUNO ME LO ESPRIMA PRATICAMENTE...VEDIAMO COSA SAPETE FARE...SCHERZO!! SIETE I MEJO  |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2008 : 10:10:22
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Il problema sei tu che ti esprimi come al cacchio e sei molto confuso
se scrivi che vuoi estrarre un gene che conosci, e' diverso da dire cercare un gene
se dici che conosci la proteina e' diverso da dire non conosco niente..ma solo per esempio..che ne so' un fenotipo
cmq...quando avrai capito queste differenze leggiti questo link
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=6524 |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2008 : 18:18:41
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allora !! io mi scuso perche quel sms lo avevo postato un pò di tempo fa ! cmq ora ho capito molto bene il clonaggio dei geni ..e quel tuo link mi è stato utile per rimettere apposto cio che ho studiato !! grazie. cmq la domanda iniziale è come estrarre un gene che conosco....evidenti segni di sbandamento...perche se ci fai caso la risposta gia l'ho scritta io...PCR.... ma nn ne ero convinto!!!
Ora cmq completo la mia domanda da solo:
una volta che ho estratto il DNA dalla cellula (per esempio linfocita oppure amniocita , insomma da una cellula nucleata )e aver fatto la PCR di quel gene usando appositi oligonucleotidi preventivamente sintetizzati posso per esempio inserirlo in un vettore di espressione e studiare la sua funzione in vitro , può essere un esempio . che ne dici ? |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2008 : 18:23:13
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ma tu non leggi quello che scrivo ...le cose che scrivo io sono importanti!!!!
vedi sopra...
...cmq hai votato? |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2008 : 11:48:53
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| claro que si |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2010 : 12:49:37
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Cio Bepo e tutti voi ragazzi!
Io devo fare la stessa tua cosa: clonare in un plasmide di espressione un gene. Io farei tutti i passaggi ke descrivevi tu, bepo.
Corregetemi se sbaglio: facendo la RT e disegnandomi i primers sul cDNA, evito di clonare anche gli introni, che nn mi servono!
MA il mio dubbio + grande è: come disegno i primers sul cDNA? il forward lo disegno nel 5'UTR, ma come faccio a fare il reverse, essendo sicura di non perdere la parte finale della proteina?
Grazie. |
Ascoltami con gli occhi... |
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estrarre un gene
