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Nunzia
Nuovo Arrivato
Città: Roma
4 Messaggi |
 Inserito il - 21 aprile 2008 : 09:51:47
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Ciao a tutti!
ho un problema con l'RNA che estraggo ( con il trizol) dalle mie cellule in sospensione. Facendo lo spettro del'RNA trovo non solo un picco a 230 e uno a 260 ma uno a 270!!!! Il rapporto 260/280 si aggira però intorno a 1,6.
Sapete dirmi secondo voi da cosa può dipendere e se questo può causare problemi con le successive RT-PCR?
grazie mille
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2012 : 15:23:45
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Ciao a tutti, io estraggo RNA da cell in adesione usando il Trizol (Invitrogen): quando quantifico al nanodrop la resa è abbastanza buona, ma il picco è spostato a 270nm (a 260 ho solo una "gobba")...il mio capo ha visto su internet che a 270nm esce il fenolo.....
io parto da piastre da 60mm 300.000cell/plate, uso 600microlitri di trizol_screpero_spipetto_lascio 5min a RT e aggiungo 120 microlitri di cloroformio_ picchietto un po' i capioni, lascio 2min a RT e centrifugo come da protocollo standard Invitrogen...al momento di prelevare la fase H2Osa ho notato che le proteine non sono ben stratificate, ma formani un alone bianco sulle pareti dell'eppendorf...così ho aumentato il tempo di centrifuga.... poi seguo alla lettera il protocollo Invitrogen finchè risospendo il campione in acqua e lo conservo a -20°C. COsa suggerite per eliminare questa contaminazione di fenolo? E' possibile e utile un secondo passaggio in cloroformio? In tal caso cosa devo fare? Secondo voi è sensato aggiungere nuovamente 120 microlitri di cloroformio alla fase acquosa già separata? E' in questo caso ricentrifugando la fase con l'RNA risulta ben separabile dal sottostante cloroformio? Nunzia, ho visto che il tuo post è vecchio, ti ricordi come hai risolto?
Aiutoooooooooooo. Grazie a tutti per l'attenzione e gli eventuali graditi suggerimenti |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2012 : 16:44:37
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Ciao! Il lavaggio con etanolo al 75% finale lo fai? Quello già di per sé aumenta notevolmente la purezza del campione... Io in genere comunque asciugo sempre le pareti della provetta dopo la precipitazione con isopropanolo, prima di risospendere in etanolo, e dopo il lavaggio in etanolo, prima di risospendere in acqua/TE buffer.
Per la centrifugata non ti saprei dire, io faccio centrifugate da 15 minuti a 4°C però a 14000 rpm invece dei 12000 xg del protocollo Invitrogen (con la centrifuga che uso io, corrispondono a circa 21000 xg) e la stratificazione viene molto bene...
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“Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing”Werner von Braun |
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picco RNA a 270!!
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