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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 26 aprile 2008 : 10:12:47
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carissimi amici ho bisogno del vostro aiuto: sto studiando degli articoli su esperimenti con markers molecolari tipo rapd e issr per poi provare in lab.Il mio prblema sta nel capire i volumi che eventualmente devo utilizzare nella mia pcr.Vi riporto uno stralcio dell'articolo relativo a materiali e metodi utilizzati:
"ogni amplificazione č costituito da un volume di 25 microlitri contenenti 20mM tris-hcl, 50 mM Kcl, 20mM Mgcl2, 800microM dNTP in ugual rappoto tra loro, 0.5microM di ciascun primer ,1U di taq, 30 ng di templato."
Quindi il mio problema visto che sono alle prime armi č Come calcolo i volumi di ciascun reagente per amplificazione dato il volume finale e le singole concentrazioni?aiutatemi.
grazie
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chick80
Moderatore
Cittā: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2008 : 10:22:08
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E' semplice, ma ti manca un altro dato: la concentrazione dello stock.
Ad esempio, se parti da una soluzione 200mM di Tris, siccome vuoi avere 20mM vuol dire che la devi diluire 1:10. Quindi su 25ul dovrai averne 25/10 = 2.5ul di tris.
Se invece partissi da una soluzione 100mM dovresti diluire 1:5 e quindi dovresti mettere 25/5=5ul di Tris per ottenere la concentrazione finale di 20mM.
Lo stesso vale per gli altri reagenti, a parte il templato che avrai quantificato con lo spettrofotometro probabilmente. Ad es. se hai 6ug di templato in 0.5 ml allora dovrai metterne 1/200 del volume nella tua reazione: 6ug/200=30ng). Quindi 1/200 di 0.5 ml sono 2.5ul
Per la Taq, invece devi vedere sulla provetta quante U ci sono per microlitro e regolarti di conseguenza. Ad es. se ci sono 10U/ul allora visto che te ne serve 1U metterai 0.1ul
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2008 : 10:27:20
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| grazie infinite chick |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2008 : 09:21:54
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| Se io ho una stock solution di dntp a 100microM č mai possibile che in 25 microlitri io possa avere una conc. di 800microM ? Mi sembra che gli appunti del mio collega siano sbagliati.Voi che ne pensate....che concentrazioni stock utilizzate.a presto |
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chick80
Moderatore
Cittā: Edinburgh
11491 Messaggi |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2008 : 10:55:00
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| grazie chick anche io ritenevo ci fosse un errore...non poteva essere in quel modo. |
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help: calcolo volumi per pcr
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