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atropos
Nuovo Arrivato

Citt�: Firenze

52 Messaggi

Inserito il - 02 giugno 2008 : 17:31:45

Ciao a tutti!

Scusate ma nella trasfezione che caratteristiche deve avere il plasmide contenente il mio gene d' interesse?

...........il plasmide si deve integrare col Dna cromosomico della cellula uovo?

Un' altra domanda:

Ho un plasmide con il promotore della metallotioneina e il mio gene d'interesse(gene dell'ormone della crescita di topo).Questo viene iniettato tramite microiniezione in un pronucleo di una cellula uovo di topo fecondata che poi viene introdotta in una madre adottiva!
Il plasmide si integra col DNA cromosomico?
Come faccio ad ottenere i topi "giganti" mostrati nel mio libro?
Ovviamente servir� del Cd.....ma quando????

Sono molto confuso!

Aiutatemi grazie!!!

Dionysos
Moderatore

Citt�: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 02 giugno 2008 : 23:19:38

I casi sono due:

> Stai parlando di un esperimento di TRANSGENESI,
in cui si ricorre alla RICOMBINAZIONE OMOLOGA per
inserire un transgene, e quindi ottenere un animale
transgenico (anche se in questo caso, direi che il
tuo gene non � 'estraneo' al topo)

--> In questo caso il plasmide si integra nel
genoma tramite ricombinazione omologa

> Stai parlando di un esperimento di TRANSFEZIONE STABILE
in cui si ricorre semplicemente ad una selezione antibiotica.

--> In questo caso il plasmide non si integra spontaneamente,
ma solo se sottoponi la cellula transfettata ad una pressione
selettiva (cio� ad un antibiotico, la cui resistenza � contenuta
nel plasmide) che 'costringe' la cellula a integrarlo nel genoma
tramite ricombinazione causale, non omologa: casuale.

Volere libera : questa � la vera dottrina della volont� e della libert�
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

atropos
Nuovo Arrivato

Citt�: Firenze

52 Messaggi

Inserito il - 03 giugno 2008 : 10:32:27

Ciao Dionysos!

Scusa ma non ho capito!

Il mio libro sta parlando di TRASFEZIONE.

Per� non si capisce niente!

1 In una pagina c'� scritto che il "gene d' interesse" viene iniettatto per microiniezione in uno dei 2 pronuclei di una cellula uovo fecondata di topo.A questo punto la cellula uovo viene trapiantata in una madre adottiva e alcuni individui della progenie(da individuare mediante PCR) presenteranno il transgene!

Queste sono praticamente le testuali parole del libro!
Questo gene non so come viene inserito!!!!........se sottoforma di plasmide o che altro!

2 Nella pagina seguente c'� una figura con scritto: l'iniezione del gene dell' ormone della crescita in una cellula uovo fecondata porta ad un TOPO GIGANTE.
Un' altra figura con scritto: il gene per l' ormone della crescita di topo � stato inserito in un plasmide accanto al promotore della metallotionina, che � attivato dall' aggiunta di metalli pesanti come ioni cadmio.

Spero tu mi possa rispondere ad entrambi i quesiti perch� sono davvero confuso!!!

Grazie 1000!

Simona84
Utente Junior

Citt�: milano

131 Messaggi

Inserito il - 03 giugno 2008 : 12:31:35

per la domanda 1 il tuo transgene deve essersi sicuramente integrato nel genoma problabilmente come dice dionysos per ricombinazione omologa. normalmente il transgene viene iniettatto nel pronucleo maschile.
per la domanda numero 2 penso semplicemente che sia per spiegare il fatto dell'utilizzo di alcuni promotori che non danno un'espressione costitutiva ma che possa essere indotta dall'esterno. secondo me parla di plasmide perch� il costrutto per essere amplificato prima dell'utilizzo per la transgenesi deve essere inserito all'interno di un vettere.di solito poi prima di attuare la transgenesi il plasmide viene tagliato con enzimi specifici in modo da utilizzare solo il frammento di interesse che poi per essere trasmesso alla progenie dovr� integrarsi stabilmente nel genoma.
non so se ho capito bene le domande ma rispondere solo in base alle informazioni che hai dato � un p� difficile non avendo il discorso completo!
ciao

atropos
Nuovo Arrivato

Citt�: Firenze

52 Messaggi

Inserito il - 03 giugno 2008 : 16:44:24

Ma quindi secondo te viene integrato solo il gene nel DNA cromosomico e non tutto il plasmide?

Non so perch� dopo ho un' altra pagina dove c'� la produzione di una proteina d'interesse nel latte di una pecora transgenica!

Praticamente il vettore d'espressione eucariotico(plasmide col gene d'interesse e promotore della B-latoglobulina) viene iniettato per microiniezione nel pronucleo di una cellula uovo di pecora e successivamente trapiantato in una madre adottiva.La pecora si accoppia e la progenie transgenica viene identificata tramite PCR!
Gli individui transgenici producono quindi del latte contenente la proteina d'interesse visto che il promotore della B-lattoglobulina � attivo solo nel tessuto mammario!

Quindi qui il plasmide si inegra nel DNA cromosomico....o mi sbaglio?
Non pu� essere cos� anche nel caso dei "TOPI GIGANTI"?
Ma se cos� fosse il Cd i topi da dove lo prendono per attivare la trascrizione?

atropos
Nuovo Arrivato

Citt�: Firenze

52 Messaggi

Inserito il - 05 giugno 2008 : 09:56:06

............Non c'� proprio nessuno che sappia qualcosa su questo argomento?

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