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tempo84
Nuovo Arrivato
Prov.: Verona
Città: san bonifacio
10 Messaggi |
 Inserito il - 17 giugno 2008 : 15:21:09
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Ciao ragazzi, ho un problema con la PCR. In pratica dovrei amplificare la regione 16S di batteri presenti in suolo.
Per far cio' ho estratto tramite kit il dna totale e la resa è molto buona, ma quando poi si tratta di fare il 16s niente da fare. Le ho provate tutte cambiato le [], le temperature ecc. Se qualcuono mi sa dire come fare o se ha avuto i miei stessi problemi s faccia sentire grazie mille..
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2008 : 16:10:41
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Prova ad usare un altro kit, io ne usai uno della promega che dava rese altissime, però poi le pcr non venivano, qualcosa dava fastidio alla Taq (probabilmente residui di ferro).
Inoltre ricontrolla i primer, quando un pcr non va, 9 volte su 10 sono i primer. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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tempo84
Nuovo Arrivato
Prov.: Verona
Città: san bonifacio
10 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2008 : 15:06:13
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| i primer li ho controllati e su altri campioni vengono, addirittura su pcr da colonia che sono piene di polisaccaridi e proteine. Ho fatto la quntificazione tramite biofotometro e il valore di A nel rapporto 260/280 è basso circa 1.3 che indicherebbe contaminazione da proteine...xo' non capisco..dovrebbe venire lo stesso.... |
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Pabe
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
15 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2008 : 16:14:02
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| Prova a ripulire il DNA dopo il kit con una classica precipitazione. |
Se puzza è chimica
Se è verde e si muove è biologia
Se non funziona è fisica |
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tempo84
Nuovo Arrivato
Prov.: Verona
Città: san bonifacio
10 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2008 : 18:59:02
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ci avevo pensato ma poi ho fatto un ulteriore analisi.. il rapporto 260/230 è di 0,02 di media..quindi ho un macello di acidi umici..il rapporto 260/280 è anch'esso di circa 1.4/1.5 quindi ho inquinamento da proteine che non dovrebbe cmq interferire cn la pcr...xo' gli acidi umici sn troppi..c'e' qualkuno ke conosce un protocollo x eliminarli partendo da dna gia' estratto..basta un semplice lavaggio?
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pcr difficoltosa
Didattica
