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biokiu
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
 Inserito il - 07 luglio 2008 : 08:53:27
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ciao a tutti! devo progettare due primer per amplificare questa sequenza e creare due siti di restrizione per EcoRI all'inizio e BamHI alla fine.
5’ATGAAACCAT TCTTCCTCAT TTCGCTGCTG GTCACGGTCT TCATGAGCCT
CATGTTGGCC ACCACCGCTC AACCCAGCCT TCCACTCAAC AACCGGCGGG
AACTTGCTGA GCATCCCCCA GTCAAGGGTA ACCCCCCAAA CACCGGCTAT
GCACTAGACT GGTGCAAATA CACAGCCGGA ATGCTATTTC AGTGGGATCT
CCCGACGTTT ATCAAGCATC GCGAGGCAAA CTTCAGCCTC GGACGGCTGA
CGTGGGACTG GTCGTCGGAT GGGTGTACCC ACGTCCCGGA CAATCCGGTT
GGCTTCCCAT TCAAGCCGGC GTGCCAGCGT CACGACTTTG GATACCGGAA
CTACCAGGTC CAATTCCATT TTACCCCGCG TGCTAGATGG AAGATTGACG
AGAATTTCCT CAAAGACATG AAATTCCAGT GCATAGGGCA CAACATCTTC
AATGCCTGCC ACTTCATGGC ACATGTTTAT CATTGGGGAG TCCGAACCTT
CTATAAAGGC CATGAGCAAT ACCGTGAGAG TGAGCCGTCT CACAAGATGA
TGGACACGAT GGTCGCTTCT GAATCGTCGG ACGTGTTTGA TGGGATGGAC
GCCGATGAAG CGAGGGACGC TCTCAATCCA TATCTTTCTG AAGAGAAGAC
CAAAGAGTAC TACGATCGTG CCCTAGCGCG TTACAACAAG TGTGTTGAGG
AAGCCATGGC GCAAGGCATT GACCTTCAGA AATACTGGGC CGCTTTTTAG 3’
mi aiutate per favore? grazie! 
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2008 : 15:00:50
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Beh immagino che tu debba amplificare la sequenza intera, quindi non ti resta altro che disegnare i primer complementari all'inizio e alla fine della sequenza e aggiungre alle estremità i siti di restrizione.
Primer Forward: 5'- sito per EcoRI + sequenza "iniziale" - 3'
Primer Reverse: 5'- sito per BamHI + sequenza "finale" (complementare, invertita)- 3'
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biokiu
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2008 : 15:15:18
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| però in questo modo il primer reverse ha il 50% di CG, mentre l'altro no. non dovrebbero avere una stessa Tm? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2008 : 18:05:01
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Io non mi sono messa a guardarli, comunque ne puoi fare uno più lungo e uno più corto in modo da avere una temperatura di melting simile o puoi aggiungere della altre basi prima o dopo la sequenza per gli enzimi di restrizione, purchè la parte che sia appaia al tuo stampo non diventi poi troppo corta!
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2008 : 21:03:44
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| Attento a BamHI, è un enzima molto poco efficiente. Aumenta i tempi di digestione rispetto a quelli consigliati, è un suggerimento che mi sento di darti. E ricontrolla sempre risultati "sospetti". |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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biokiu
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2008 : 14:27:10
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grazie! ho allungato e la temperatura è simile, sembra che vada bene.o almeno spero!
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primer per prc
Didattica
