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Cilla87
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2 Messaggi |
 Inserito il - 07 luglio 2008 : 16:37:03
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ciao  sono una studentessa del secondo anno di biologia..sono alquanto ignorante in materia ,ma necessito d un aiuto!!qualcuno ha voglia e/o tempo d dirmi cm si estrae un plasmide da Ecoli? ?Help me ve ne saro` grata in eterno
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Topogigio77
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Città: Milano
37 Messaggi |
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vesania
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Città: rovigo-ferrara-rovigo
98 Messaggi |
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crischi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 09 luglio 2008 : 17:51:46
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Citazione:
Messaggio inserito da Cilla87
ciao sono una studentessa del secondo anno di biologia..sono alquanto ignorante in materia,ma necessito d un aiuto!!qualcuno ha voglia e/o tempo d dirmi cm si estrae un plasmide da Ecoli??Help meve ne saro` grata in eterno
l'estrazione di DNA plasmidico normalmente si esegue con un kit.....prima devi concentrare tutti i batteri....risospendere il tutto con dei buffer appropriati...poi c'è la lisi cioè la rottura delle cellule che ti permette di estrarre il DNA...si effettuano dei lavaggi e si eluisce con un buffer....spero di acerti aiutato
ciao |
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giov.linux
Nuovo Arrivato
Prov.: Bolzano
Città: napoli
14 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2008 : 00:53:31
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OK a lezione ti fanno la testa di chicchere ma in realtà è una cosa banale, si usano kit delle colonnine che vanno centrifugate(1 o 2 €/colonna). Per tutti i kit che usato (qiagen rosh e altri) la procedure è la stessa:
6ml di cultura batterica
1) 2ml di cultura si centrifuga 30 secondi 13000 rpm su una centrifuga da banco e si scarta il sovranatante
2) Si aggiungono altri 2 ml e si ripete 1
3) Si aggiungono altri 2 ml e si ripete 1
4) si risponde il pellet in 200 ul un buffer 1
5) si aggiunge al pellet 200 ul in un buffer 2 e si vortexa
6) si agginunge al pellet in 200 ul di un buffer 3 e si vortexa
apparirà un floculo nel tubo, hai appena fatto la lisi alcalina (NaOH e SDS)
7) 5 min al massimo giro
8) preleva il sovranatante lo carichi su una colonnina e 30 sec al massimo dei giri ( su pompa spirante)
9) altri due sciacqui per pulire il dna con 2 buffer (uno con etanolo)
10 eluizione con 20ul di H2O
tempo necessario 20 minuti con piccola pausa caffè... banale
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giov.linux
Biologo Molecolare |
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matrixfede
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2008 : 19:02:45
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Se sei al secondo anno, deduco che ti serva saperlo per qualche esame o relazione...
Cmq l'estrazione del dna plasmidico da coli si effettua mediante lisi alcalina. Riporto un estratto di una relazione dove viene spiegata la lisi alcalina:
Per estrarre il plasmide ci siamo serviti di una tecnica che prevede la centrifugazione della cultura e la
rimozione del terreno sopranatante. Dopo la rimozione del terreno abbiamo aggiunto GTE cioè una
soluzione di glucosio, tris-HCl e EDTA.
Questa operazione serve per ricreare una situazione analoga a quella interna della cellula per quanto
riguarda la presenza di glucosio, tampone(tris-HCL) e agente complessante di ioni
bivalenti(Mg++),cioè EDTA(Acido etilendiamminicotetracetico). L’aggiunta dell’EDTA ci serve ad
eliminare gli ioni Mg. Poiché le nucleasi hanno bisogno di Mg per essere attive, eliminandolo
evitiamo che si generino tagli. Poiché il glucosio aumenta la concentrazione all’esterno della cellula,
l’acqua per osmosi esce all’esterno per bilanciare la concentrazione e la cellula si raggrinzisce; poi
con l’aggiunta di SDS e NaOH avviene la lisi poiché la parete è denaturata dal detergente. In questo
modo denaturiamo anche gli acidi nucleici e rompiamo l’RNA. Successivamente aggiungiamo KOAc
(potassio acetato),creiamo basso ph e troviamo il plasmide denaturato che, però, essendo una
molecola piccola,riesce a rinaturarsi molto facilmente al contrario del DNA che ,essendo molto più
grande, rimane sul fondo della provetta.
Per eliminare tutti i residui come proteine e lipidi e per evitare che interagiscano con l’estrazione in
fase organica, si aggiunge fenolo e cloroformio (CHCl3). Si formano così 2 fasi: una acquosa(sopra)
ed una più densa dovuta alla presenza di cloroformio(sotto). Si centrifuga e si trasferisce la fase
acquosa in una nuova eppendorf, poiché in questa fase si trova il plasmide. Si aggiunge isopropanolo
che disidrata il dna e il plasmide precipita poiché i fosfati hanno carica negativa. Si elimina il
sopranatante e si aggiunge etanolo per eliminare tutti i residui. Il plasmide non si risospende e si
elimina il sopranatante. Si essicca il pellet e si aggiungono 15-20 microliti di acqua sterile |
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Army
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
30 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2009 : 12:47:38
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Salve io sto usando questo metodo per l'estrazione di DNA ma ho avuto problemi sul pH del KOAc, il mio protocollo dice di arrivare ah un pH di 4,8 E 3 molare ma ho prolemi a farlo scendere oltre 5,3 e quindi sforo continuamente con il volume; non è che sapete aiutarmi o darmi qualche consiglio???
Grazie mille
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