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Angy88
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 12 luglio 2008 : 09:18:13
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Ciao c'è qualcuno che può aiutarmi? vorrei sapere in cosa consiste ( una spiegazione semplice) la pcr allele specifica..graziee
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2008 : 10:31:31
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Serve per discriminare diversi alleli, e quindi per genotipizzare l'individuo in questione.
Di solito si disegna un primer che termina in 3' nel nucleotide che determina la differenza tra i due (o piu') alleli.
ALLELE 1
3' TTGACCGATCATTCAAGTCAAGTCCAAG 5'
>>>>>>>>>>>>>>
5' AACGGCGTAGTAAG 3'
ALLELE 2
3' TTGACCGATCATTAAAGTCAAGTCCAAG 5'
>>>>>>>>>>>>>>
5' AACGGCGTAGTAAT 3'
Se la PCR 1 funziona e la 2 no --> Omozigote allele 1
Se la PCR 2 funziona e la 1 no --> Omozigote allele 2
Se funzionano entrambe --> Eterozigote
(chiaramente per entrambe le PCR usi anche un primer reverse..)
Questo è solo un esempio, tieni presente che ci possono essere anche alleli che differiscono in numero di basi.... Ma il principio è sempre lo stesso: disegnare primer che possano amplificare solo una delle due forme alleliche!
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Angy88
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2008 : 11:03:41
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grazie valia  |
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2008 : 11:31:05
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| Hmm..l'unica cosa di cui non sono certa è che sia il nucleotide al 3' a determinare la dfferenza.. Il disturbo all'appaiamento non dovrebbe essere maggiore se il mismatch cade al centro? |
Nasce, cresce e poi finisce. Per quanto triste è la legge universale.
Ciò che è stato nn tornerà. Il massimo che puoi fare è sperare che quello che sarà, sia meglio.
Nessun rimorso nè rimpianto, è inutile.
Carpe diem: panta rei |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2008 : 15:20:26
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Citazione:
Messaggio inserito da Rosy85
Il disturbo all'appaiamento non dovrebbe essere maggiore se il mismatch cade al centro?
No che io sappia è al 3'! E' lì che si attacca la polimerasi, ed è lì che l'appaiamento tra primer e templato deve essere ottimale, se si vuole che la PCR funzioni...
Primer con mismatch interni o al 5' possono funzionare benissimo... |
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2008 : 15:39:45
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| ah io intendevo dire che con un mismatch al centro il primer non si appaia affatto |
Nasce, cresce e poi finisce. Per quanto triste è la legge universale.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2008 : 21:47:55
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Citazione:
Messaggio inserito da Rosy85
ah io intendevo dire che con un mismatch al centro il primer non si appaia affatto
Assolutamente NO!!!
Un primer con un mismatch in mezzo si appaia benissimo, anzi è un metodo utilizzato per mutagenizzare, sostituzione di un singolo nucleotide!
Invece se non si appaia al 3' la Taq non può proprio polimerizzare! (come diceva Valia!)
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2008 : 23:56:52
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 avevo studiato che era così per le ASO, qual è la differenza?la lunghezza della sequenza? |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2008 : 00:03:06
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La ASO-PCR è quello di cui stiamo parlando "Allele-Specific Oligonucleotide Polymerase Chain Reaction".... Forse ricordi male?
Di che differenza parli? |
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2008 : 09:19:15
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Non parlavo di una PCR, ma della marcatura cone le sonde ASO: una sequenza di una ventina di nucleotidi marcata con fluorescenza che permette di distinguere un allele da un altro. Il punto di mismatch deve essere quanto più possibile al centro della sequenza perchè è lì che si ha la massima interferenza: quando la sonda ibrida e poi si innalza la temperatura, se il mismatch è al centro la sonda si stacca; un mismatch lungo "le code" viene tollerato meglio.
Trattandosi ora di una PCR, credevo che il meccanismo fosse lo stesso: mismatch al centro = appaiamento non avviene.
Ma credo di aver capito la differenza: nel procedimento di cui parlavo io bisogna innalzare la temperatura perchè il mismatch possa interferire; invece nella PCR l'elemento discriminante è l'attacco della taq che ovviamente avviene al 3'.
Ho capito bene? |
Nasce, cresce e poi finisce. Per quanto triste è la legge universale.
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2008 : 10:12:05
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Citazione:
Messaggio inserito da Rosy85
Ma credo di aver capito la differenza: nel procedimento di cui parlavo io bisogna innalzare la temperatura perchè il mismatch possa interferire; invece nella PCR l'elemento discriminante è l'attacco della taq che ovviamente avviene al 3'.
Ho capito bene?
Esatto!! |
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2008 : 11:58:44
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thanx  |
Nasce, cresce e poi finisce. Per quanto triste è la legge universale.
Ciò che è stato nn tornerà. Il massimo che puoi fare è sperare che quello che sarà, sia meglio.
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Grace_92xx
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2016 : 18:17:01
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Citazione:
Messaggio inserito da Rosy85
Non parlavo di una PCR, ma della marcatura cone le sonde ASO: una sequenza di una ventina di nucleotidi marcata con fluorescenza che permette di distinguere un allele da un altro. Il punto di mismatch deve essere quanto più possibile al centro della sequenza perchè è lì che si ha la massima interferenza: quando la sonda ibrida e poi si innalza la temperatura, se il mismatch è al centro la sonda si stacca; un mismatch lungo "le code" viene tollerato meglio.
Trattandosi ora di una PCR, credevo che il meccanismo fosse lo stesso: mismatch al centro = appaiamento non avviene.
Ma credo di aver capito la differenza: nel procedimento di cui parlavo io bisogna innalzare la temperatura perchè il mismatch possa interferire; invece nella PCR l'elemento discriminante è l'attacco della taq che ovviamente avviene al 3'.
Ho capito bene?
Ciao a chiunque voglia darmi una mano.. sono alle prime armi con lo studio delle tecniche di biologia molecolare e non riesco davvero a capire la differenza tra ARMS-PCR, ASO-PCR e COP (Competitive Oliopriming) per quanto riguarda le sonde (primers) utilizzate e soprattutto il punto in cui cade il mismatch all'interno di esse...
Credevo che l'ARMS utilizzasse primers con mismatch al 3', l'ASO con un mismatch interno, e la COP non ne ho idea..
Qualcuno potrebbe aiutarmi? ho un esame la settimana prossima... |
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PCR allele specifica
Didattica
