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dabar
Nuovo Arrivato


Prov.: Catania
Città: Catania


30 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2008 : 16:59:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di dabar  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di dabar Invia a dabar un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
mi sto apprestando a fare un'esperimento di Real-Time con sonde TaqMan alcune delle quali sn disegnate su singoli esoni, quindi devo trattare con DNasi i miei campioni.
Ho fatto già diverse prove di trattamento utilizzando 1 e 2 ug di RNA e trattandolo con DNasi (secondo protocollo Invitrogene) ma ciò che ho notato è che si ha una riduzione variabile dal 25 al 50% della massa totale di RNA.
Avete esperienza a proposito?
I trascritti più rari si osservano lo stesso?
Posso ovviare al problema mettendo più massa di cDNA per effettuare la Real-Time?
Grazie anticipatamente a tutti coloro che mi risponderanno.
Dabar

Topogigio77
Nuovo Arrivato


Città: Milano


37 Messaggi

Inserito il - 15 luglio 2008 : 11:16:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Topogigio77 Invia a Topogigio77 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,
molto dipende dalla DNase che usi. Quelle classiche prevedono inattivazione col calore, che tanto bene al RNA non fa.
Prove quelle nuove con la Stop Solution (es: Turbo DNase di Ambion). Per i geni poco espressi non serve tanto aumentare il cDNA: considera che anche mettendone il doppio guadagni 1 Ct, con 10 volte tanto guadagni poco più di 3 Ct ma entra in gioco il meccanismo dell'inibizione, percui io eviterei. Piuttosto pre-amplificherei il cDNA, è 1 passaggio da 1 ora e non avrai più problemi di non vedere geni poco espressi. Se ti interessa il prodotto fammi sapere che te parlo, io lo uso da un annetto. ciao
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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 15 luglio 2008 : 14:54:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
A me interessa la preamplificazione, puoi metterla qui o nei protocolli? Anch'io uso la Turbo della Ambion.
Grazie
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Topogigio77
Nuovo Arrivato


Città: Milano


37 Messaggi

Inserito il - 17 luglio 2008 : 12:07:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Topogigio77 Invia a Topogigio77 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ecco qua la pre-amplificazione:

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042472.pdf

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042471.pdf
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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2008 : 16:13:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille!
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