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dabar
Nuovo Arrivato
Prov.: Catania
Città: Catania
30 Messaggi |
 Inserito il - 12 luglio 2008 : 17:19:45
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Ciao a tutti,
pochi giorni fa ho estratto dell'RNA da 2 fiasche da 25 cm2 a subconfluenza di cellule alfa e beta pancreatiche murine, utilizzando il classico protocollo Trizol, direttamente da fiasca (nn ho pellettato cioè le cellule prima di estrarre l'RNA).
Ho ottenuto dei pellet di RNA abbastanza consistenti ma nonostante questo ho voluto risospenderli in poca acqua (15 ul) per poi eventualmente diluire l'RNA in fase successiva.
Lo stesso giorno ho fatto la lettura allo spettrofotometro ed ho avuto concentrazioni di circa 6ug/ul per le alfa e 9 ug/ul per le beta.
Pensando che tali valori fossero esagerati (dato che l'estrazione è stata fatta da fiasche da 25) ho voluto rileggere l'indomani con un altro spettrofotometro.
Bene..le letture erano completamente diverse (ca. 2ug/ul per entrambe).
Sulla base di queste letture nuove ho fatto le diluizioni a 10ng/ul ed ho fatto una RT-PCR One step (Beta-actina a 24 cicli) portandomi dietro come controllo di massa un RNA sicuramente 10 ng/ul.
Il risultato è stato che i miei campioni erano completamente a saturazione, indicando quindi una grossolana sottostima nella seconda lettura.
Ho dimezzato quindi le masse e stimato sulla base di analisi densitometrica sul gel di agarosio quante volte maggiore fosse la massa del mio RNA (stimato 10 ng/ul) rispetto al reale 10 ng/ul.
Ottenuto i valori matematici ho fatto le opportune diluizioni...ma ancora il risultato era saturazione...
Alla fine avendo il problema di dovere necessariamente usare l'RNA dei miei campioni a concentrazioni ben definite ho deciso di rileggerli sempre con il secondo strumento, facendo delle diluizioni a scalare..INCREDIBILE!!!..le letture tornavano a confermare la prima lettura...alla fine mi sono basato su queste ultime letture (cioè le prime- dal momento che due spettrofotometri diversi hanno alla fine confermato la stessa lettura) per fare l'esperimento...(SPERIAMO BENE!!!).
Mi chiedo:
1)Secondo voi la procedura seguita è corretta?
2)Secondo voi cosa è successo durante le letture?
3)Avete mai estratto da questo tipo di cellule? e se si avete ottenuto rese di questo tipo?
A presto.
Dabar
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Letture allo spettrofotometro
Didattica
