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là
Utente Junior

565 Messaggi

Inserito il - 16 luglio 2008 : 17:00:37

carissimi, ho una domanda da porvi!
ho quantificato un prodotto di pcr, l'ho digerito, ma sul gel non si vede niente di niente!
La concentrazione è 1 ug/ul, e ne ho digeriti 10ul....e ripeto che non si vede nulla....
il rapporto 260/280 è 5.05...una schifezza. potrebbe essere questa secondo voi la causa del fatto che ho digerito un sacco di dna e non vedo nulla?
Anche se la digestione non fosse venuta avrei dovuto vederlo!
Grazie!

E. Coli
Nuovo Arrivato

22 Messaggi

Inserito il - 16 luglio 2008 : 17:04:37

e se avessi l'acqua in cui hai preparato la reazione di digestione contaminata da DNasi? a me è capitato...

là
Utente Junior

565 Messaggi

Inserito il - 16 luglio 2008 : 17:18:46

pero' ho digerito anche altri campioni e quelli si vedono..e sono meno concentrati.
oltretutto i campioni mi sono stati dati, quindi non ho purificato io il prodotto di pcr da gel.a dire la verità non so nemmeno se è stato purificato da gel...magari potrebbe essere colpa dei sali?
e poi c'è il rapporto 260/280 che non mi convince.
Fatemi sapere tutto quello che vi viene in mente se avete tempo, ogni ipotesi è ben accetta!
Grazie a tutti!

E. Coli
Nuovo Arrivato

22 Messaggi

Inserito il - 16 luglio 2008 : 17:43:54

Se il prodotto di PCR è stato purificato da gel allora è molto probabile che il rapporto 260/280 sia attendibile e che la purificazione non sia avvenuta a dovere...io odio purificare da gel!
di solito carico una piccola parte di prodotto di PCR su gel...se il buffer della polimerasi, i dNTPs in eccesso etc sono un problema per gli esperimenti successivi allora precipito la quantità rimanente di prodotto di pcr con EtOH/CH3COONa per appunto eliminare sali etc...secondo me il problema non è la digestione ma il fatto che da gel non è stato purificato niente :(
ciao!!

là
Utente Junior

565 Messaggi

Inserito il - 17 luglio 2008 : 18:54:05

e infatti è molto probabile visto che oggi ho parlato con la tizia che mi ha dato i campioni e mi ha detto che non era certa di cosa mi aveva dato..........

Cmq grazie!

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