trattamento con DNAse pre-estrazione DNA

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Autore

Discussione

swiss_redfox
Nuovo Arrivato

Citt�: Lausanne

12 Messaggi

Inserito il - 18 luglio 2008 : 13:52:53

Ciao a tutti!

Ho una domanda riguardante l'estrazione di DNA da cellule di mammifero. Il mio obiettivo finale � di quantificare il numero di copie di DNA plasmidico che sono riuscita a trasfettare nelle mie celluline.
Ho un protocollo che come primo step prevede il trattamento del pellet cellulare con DNAse (x togliere eventuali residui di DNA che nn � entrato nelle cellule o qllo che ne � gi� uscito dalle cellule morte): la mia domanda riguarda l'inibizione dell'enzima. Normalmente si aggiunge EDTA (x chelare Mg2+ e/o Mn2+ di cui ha bisogno) e si scalda a 65�C 10' (suppongo x unfoldarlo): il problema � che in qsto caso scaldo anche il pellet cellulare...� vero che dopo devo lisare le cellule x isolare i nuclei ma nn c'� il rischio che il trattamento a 65�C mi distrugga anche gli organelli interni (nuclei compresi) in maniera incontrollata? Dall'altro lato la sola aggiunta di EDTA basta ad inibire l'enzima?

se qcno ha una risposta o pu� darmi un consiglio ... GRAZIE!!!!

elly_
Utente Junior

400 Messaggi

Inserito il - 20 luglio 2008 : 19:25:38

da quanto ho letto qua(http://www.drstaiger.com/sitebuildercontent/sitebuilderfiles/Bio110MembraneSciWritingSolutions.doc) a 70�C non dovrebbe succedere nulla alle cellule. L'hanno spiegato in un modo carino!

ciao ciao!

swiss_redfox
Nuovo Arrivato

Citt�: Lausanne

12 Messaggi

Inserito il - 21 luglio 2008 : 22:17:29

Grazie 1000 Elly!
Sito molto interessante!