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swiss_redfox
Nuovo Arrivato
Città: Lausanne
12 Messaggi |
 Inserito il - 07 agosto 2008 : 13:41:56
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Ciao a tutti!
Devo comparare in diversi campioni i livelli di siRNAs endogeni (creati contro il mio reporter di ~700bp) e pensavo di farlo tramite Northern Blot.
C'è qcno che ha già fatto un qcsa di simile e che può darmi qlche consiglio? ora come ora i miei dubbi sono su:
- estrazione siRNAs (fenolo/cloroformio? i classici kit da estrazione nn vanno bene x sequenze così corte vero?)
- sonde da usare? lunghezza? posizione sul reporter?
- gel per la separazione?
Alternativamente conoscete altre tecniche x detectare siRNAs?
GRAZIEEEE!!!!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2008 : 14:39:41
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Ciao swiss_redfox io ho lavorato con diavolerie simili
e vorrei farti notare un paio di cose:
1) Partendo dal presupposto che detectare siRNA endogeni
NON è una passeggiata, mi viene spontaneo domandarti :
se quello che stai silenziando è (come hai scritto) un gene reporter
perchè non vai a misurare i livelli di espr. del gene anzichè quelli
del siRNA, visto che in teoria un reporter è un gene facilmente
detectabile (ad es. codifica per una proteina fluorescente) ?
Tra l'altro i livelli di siRNA potrebbero non riflettere il livello
di silenziamento: la loro esistenza non documenta silenziamento,
viceversa potrebbero non essere detectabili pur in presenza di
silenziamento effettivo e funzionale.
2) Se vuoi costruire sonde per Northern blot per identificare
siRNA, queste sonde devono mappare sul siRNA (oppure
sull'shRNA se è ciò che stai usando) e non sul trascritto: anzi,
dovresti impostare le condizioni in modo tale che la sonda non
cross-reagisca con il trascritto del tuo gene (che non è detto
che sia del tutto abbattuto, visto e considerato che dovresti
lavorare in condizioni di estrema sensibilità)
3) Sono mesi che sto cercando un qualsiasi altro metodo standardizzato
per detectare siRNA endogeni diverso dal northern e ti dico: credo proprio
che non ne esistano affatto :P !!! L'intera letteratura sull'RNAi si
basa sulla misurazione dei livelli del gene, non del siRNA.
Ad ogni modo se proprio proprio vuoi avventurarti:
>Per quanto riguarda i kit di estrazione: so che esiste qualcosa
di specifico per i piccoli RNA (tipo il miRVANA o simili) ma in
teoria l'estrazione di RNA totale con fenolo-cloroformio potrebbe
bastare, a condizione che l'espressione si siRNA sia altissima.
>Per la separazione: qualsiasi articolo a riguardo ti parlerà di
corsa di RNA in gel di poliacrilamide (di solito 12%) in urea
o altri agenti denaturanti: separando a maglie strette dovresti
riuscire ad escludere sia la cross-reattività con i trascritti
sia un bel po' di aspecifici. Dovresti.
>Pper detectare siRNA (o shRNA?)espressi hai bisogno di una
sensibilità estremamente alta, tanto che non basteranno
i sistemi di marcatura con fluoresceina ma dovrai molto
probabilmente ricorrere a sistemi radioattivi(tipo fosforo 32)
ed esposizione overnight!! se non hai le attrezzature predisposte
per lavorare con il radioattivo, allora ti conviene rinunciare.
Un grosso in bocca al lupo |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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swiss_redfox
Nuovo Arrivato
Città: Lausanne
12 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2008 : 15:25:43
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Grazie 1000 x la risposta e x le dritte...anche se nn sono molto incoraggianti!
Il radioattivo e le apparecchiature ce le abbiamo, ora come ora mi preoccupa il disegno delle sonde... 
Devo detectare i livelli dei siRNA xchè ho già quantificato proteina e livelli di pDNA e mRNAs nei miei campioni. In determinate condizioni i livelli di mRNAs sono più elevati .... x cui sto cercando di capire il perchè... un'ipotesi è che ci sia meno silencing, ma nn è cosa facile da provare! un'idea che mi è venuta in mente era di detectare gli siRNAs endogeni: ed eccomi qui! ho anche già provato a guardare i livelli di proteine del complesso RISC (famiglia Ago) tramite western ma con scarsi risultati : lavoro con CHO cells e nn ci sono Ab in commercio contro Ago family anti-hamster e qlli anti-human o -mouse detectano l'N-term (che è la zona più variabile)... 
Cmq grazie ancora!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2008 : 15:43:22
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Vedo che abbiamo la stessa fortuna  !!
dev'esser proprio l'RNAi che porta sfiga.
Per caso il tuo vettore è inducibile?
Comunque per le sonde prova a guardare in letteratura: la
maggior parte della gente utilizza semplicemente unità di
19 nt radiomarcate dirette contro la 'seed region' del
siRNA. In condizioni di risoluzione di banda estremamente
alta per pesi molecolari estremamente bassi dovresti
ridurre al minimo gli aspecifici. Ah, se sono degli
RNA hairpin devi usare urea almeno almeno 8M !!
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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swiss_redfox
Nuovo Arrivato
Città: Lausanne
12 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2008 : 16:00:14
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Vedo che abbiamo la stessa fortuna !!
dev'esser proprio l'RNAi che porta sfiga.
Per caso il tuo vettore è inducibile?
Come si dice... mal comune, mezzo gaudio! 
Il mio sistema non è inducibile: ho solo un aumento di produzione di rProt qdo cambio le condizioni di coltura! E vorrei sapere: PERCHE'?!?
Cmq, in qsto gg sbatterò un po' la testa x disegnare delle sonde!!
Grazie!!!! |
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northern per siRNAs
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