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lallabell
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
 Inserito il - 26 agosto 2008 : 15:03:47
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ciao a tutti, ho una domanda da fare. perchè un limite della PCR è la lunghezza della sequenza di DNA che può essere copiata?
Si riferisce al fatto che mancherebbe la quantità di precursori dNTP necessaria per effettuare tutti i cicli che una PCR prevede?
grazie 1000 in anticipo 
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 26 agosto 2008 : 15:59:54
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Si riferisce piu' che altro alla Taq, che ogni tanto "scivola" dal DNA! Piu' lungo il templato, maggiore e' la probabilita' che la Taq scivoli prima di amplificarlo tutto.
Per amplificati lunghi (sopra le 2 Kb circa) si usano infatti polimerasi con attivita' di proofreading (Pfu, Phusion) le quali, commettendo meno errori durante la sintesi del filamento stampo, sono piu' stabili e scivolano meno frequentemente.
Poi in realta' il tasso di errore di una polimerasi dipende anche da altri fattori, come per esempio il buffer che si usa per la PCR.
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 26 agosto 2008 : 16:03:11
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| Se ci pensi i dNTPs non possono essere un fattore limitante per quanto riguarda la lunghezza, perché comunque puoi aumentare la concentrazione di dNTPs e anche fosse magari nei primi cicli potresti ottenere un amplificato anche se meno consistente...Il problema è l'enzima, la Taq arriva fino a max 1000bp mi sembra, manca dell'attività esonucleasica 5'-3' e quindi introdurrebbe troppi errori su lunghi filamenti, in più è soggetta ad "affaticamento"... |
 
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lallabell
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 26 agosto 2008 : 20:05:10
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ok, precisi come al solito  grazie
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 10 settembre 2008 : 22:14:20
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se aumenti la quantità di dNTP in una reazione di PCR rischi di ottenere amplificati squilibrati anche con taq di altissima precisione, vi faccio un esempio: io uso i dNTP con una concentrazione 1,25mM, una volta ho usato dNTP forniti con un kit di concentrazione 2,5mM pensando che fosse la solita e aggiungendo lo stesso volume. Risultato: ciascun clone del clonaggio aveva almeno una mutazione puntiforme
ma con la fortuna che ho ne ho trovato una silente |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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PCR: perche' c'e' una lunghezza massima?
Didattica
