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paolaberna
Nuovo Arrivato

5 Messaggi

Inserito il - 08 settembre 2008 : 12:47:09

Ciao a tutti....sto facendo un clonaggio con un kit della fermentas....mi consigliano di utilizzare il prodotto di PCR da cui parto con un rapporto molare 3:1 con il cloning vector....quindi?
come faccio a calcolare il volume di prodotto di PCR da utiizzare se so che devo usare 1 microlitro di vettore (50 ng/microlitro)???
Grazie mille a chi mi aiuta...

d.goldy
Nuovo Arrivato

39 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2008 : 12:55:23

Ciao,
é la prima volta che rispondo....

allora si fa cosí:

Xng(ins)= i nanogrammi di inserto (PCR) che cerchi
ng vet = ng di vettore (50)
Kb ins= numero di kbasi della PCR
kb vett= numero di KB del vett
quindi
Xng(ins):ng(vet)=Kb(ins):Kb(vet)
calcoli Xng della pcr e poi moltiplichi per 3
X ng (ins)= ng(vet)*KB(ins)*3/kb(vet)

Spero sia chiaro se no ci riprovo :)

frau_frosch
Utente Junior

Città: Boston

225 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2008 : 13:03:05

Mah... io avrei detto semplicemente che siccome hai un rapporto inserto:vettore di 1:3 e di inserto ne prendi 50 ng (ossia 1 microlitro di una soluzione 50ng/ul), ti servono 150 ng di inserto!

d.goldy
Nuovo Arrivato

39 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2008 : 14:11:17

Penso che chiunque abbia fatto un clonaggio per la prima volta abbia fatto come dice frau_frosch, ma a me non ha funzionato.
Anche perché vorrei sapere come puoi prendere in considerazione le concentrazioni senza considerare la lunghezza dei frammenti!!!

prova entrambi i modi ma poi facci sapere :)
see u